CGT研究，可不能少了慢病毒载体

慢病毒载体系统基于人类免疫缺陷Ⅰ型（HIV-1）病毒改造的，这是一种经过充分研究的人类病原体病毒。目前广泛应用于科研及临床研究的慢病毒四质粒包装系统，属于第三代慢病毒包装系统，由1个包含目的基因的表达质粒、2个包装质粒、1个包膜蛋白质粒组成。

包装质粒中含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列（RRE，ψ，LTRs），及目的基因或标记基因（绿色荧光蛋白GFP）。其中1个包装质粒包含Gag和Pol基因，Gag编码核心蛋白（基质蛋白、衣壳蛋白、核衣壳蛋白），Pol基因编码前体蛋白，经切割形成反转录酶、整合酶、蛋白酶，另1个包装质粒包含REV基因，其编码的Rev蛋白与慢病毒基因组中的RRE结合，将基因组mRNA从细胞核转运到细胞质中。

包膜蛋白质粒使用水疱性口炎病毒糖蛋白G基因（VSV-G）来替代原病毒的env基因，应用VSV-G包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，同时也增加了载体的稳定性。

基因组mRNA与衣壳蛋白、包膜蛋白等组装成假病毒颗粒。四质粒包装系统，极大地降低了产生具有复制能力慢病毒的可能性，而VSV-G蛋白的使用也降低了这种重组的可能性。

图1. 第三代慢病毒的4质粒系统^[1]。

利用慢病毒载体，可以稳定地过表达特定基因、研究启动子的调控机制、或利用RNA干扰技术来沉默特定基因的表达等。慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。为了提高转染细胞的效率，需要获得高滴度的病毒颗粒，这和包装用的细胞状态、目的基因的大小、质粒质量和收毒时机有关。包装好的病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因递送到宿主细胞之后，经过逆转录整合到宿主细胞基因组中，从而高水平地表达相应的蛋白。

根据不同的实验目的，可以选择相应的慢病毒载体，例如：

☑ 常规功能基因过表达/干扰慢病毒

☑ 非编码miRNA/lncRNA/circRNA慢病毒

☑ 基因敲除慢病毒

此外，也可以选择不同的启动子、筛选标记、表达标签或者报告基因等，满足个性化的研究需要。

图2. 慢病毒包装技术路线。（来源：赛业生物）

静息状态是免疫系统的一个独特特征，T淋巴细胞可以长时间保持不分裂状态^[3]。血液中的大多数循环T细胞处于静息状态，其特点是代谢率低、转录水平低、体积小和生存期非常长^[4]。

在Zack等人对HIV病毒的研究中^[3]，详细介绍了HIV病毒感染静息状态下T细胞的局限性。首先是静息T细胞中HIV的预整合受到抑制，和激活的T细胞相比，病毒的感染能力不变，但是逆转录存在明显差异，比如逆转录速度较慢、病毒cDNA不稳定等。其次，在静息T细胞中HIV表达存在缺陷，包括LTR缺陷、基因整合到转录抑制区域。

已有多项研究表明，包括亲本病毒HIV-1及其衍生载体在内的病毒系统可以进入静息状态下的T淋巴细胞，但不会复制^[5]。主要包括：

1.逆转录的启动以及完成过程中存在缺陷

2.缺乏ATP依赖的核输入

3.缺乏前期病毒基因组的整合

基于HIV的慢病毒载体系统在静息T细胞中的转染仍有难度。因此在转染前需要对T细胞进行激活。例如，通过T细胞受体和 CD28 共刺激受体的刺激，使用抗CD3 、抗CD28抗体，诱导静息T细胞进入细胞周期的 G1b期，可以使细胞易受HIV-1感染和复制^[6]。或者将T细胞暴露于不触发细胞分裂的细胞因子也可以使HIV-1载体完成转导^[7]。

图3. 赛业生物慢病毒转染T细胞案例。上：PBMC活化扩增第十天T细胞占比及表型分析实验结果。下：FMC63 CAR-T细胞CAR阳性率检测结果。

Leber 先天性黑蒙 （LCA16）是一种遗传性儿科失明，由KCNJ13基因的致病变异引起。KCNJ13基因编码一种结构为四聚体的 Kir7.1 亚基，该亚基在视网膜色素上皮 （RPE） 中内向整流钾离子通道，维持离子稳态并且使光感受器能够编码视觉信息。

在Pawan K. Shahi等人的研究中^[8]，验证了KCNJ13基因与Kir7.1通道的作用机制。首先，该研究组获得了KCNJ13基因缺陷的人类诱导多能干细胞（hiPSC）-RPE细胞，并验证了该细胞具有正常形态但不表达功能性Kir7.1通道，因此不具备生理活性。为了探究KCNJ13基因对Kir7.1亚基表达的影响，该研究组使用了赛业生物包装的慢病毒pLV-EF1α Kir7.1-GFP，成功地将KCNJ13基因递送至hiPSC-RPE细胞，并且恢复了Kir7.1通道功能。赛业生物的第三代慢病毒包装系统降低了产生可复制病毒的风险，在转导有丝分裂后RPE细胞中的效率更高。

图4. 使用慢病毒转染后，hiPSC-RPE 细胞膜电位恢复正常^[8]。A-C：慢病毒递送基因后膜电位恢复；D：免疫印迹分析；E：使用慢病毒转染后，hiPSC-RPE成功表达Kir7.1（绿色）。

慢病毒包装，春季拼单享优惠，三大亮点造就高品质慢病毒！

参考文献：

[1] Merten, O. W., Hebben, M., & Bovolenta, C. （2016）. Production of lentiviral vectors. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 3, 16017.

[2] Gama-Norton, L., Botezatu, L., Herrmann, S., Schweizer, M., Alves, P. M., Hauser, H., & Wirth, D. （2011）. Lentivirus production is influenced by SV40 large T-antigen and chromosomal integration of the vector in HEK293 cells. Human gene therapy, 22（10）, 1269-1279.

[3] Zack, J. A., Kim, S. G., & Vatakis, D. N. （2013）. HIV restriction in quiescent CD4+ T cells. Retrovirology, 10（1）, 1-9.

[4] Yusuf, I., & Fruman, D. A. （2003）. Regulation of quiescence in lymphocytes. Trends in immunology, 24（7）, 380-386.

[5] Verhoeyen, E., Costa, C., & Cosset, F. L. （2009）. Lentiviral vector gene transfer into human T cells. In Genetic Modification of Hematopoietic Stem Cells （pp. 97-114）. Humana Press.

[6] Korin, Y. D., & Zack, J. A. （1998）. Progression to the G1b phase of the cell cycle is required for completion of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcription in T cells. Journal of virology, 72（4）, 3161-3168.

[7] Unutmaz, D., KewalRamani, V. N., Marmon, S., & Littman, D. R. （1999）. Cytokine signals are sufficient for HIV-1 infection of resting human T lymphocytes. The Journal of experimental medicine, 189（11）, 1735-1746.

[8] Shahi, P. K., Hermans, D., Sinha, D., Brar, S., Moulton, H., Stulo, S., ... & Pattnaik, B. R. （2019）. Gene augmentation and readthrough rescue channelopathy in an iPSC-RPE model of congenital blindness. The American Journal of Human Genetics, 104（2）, 310-318.