想了解细胞产品及试剂相关内容,请点击这里进入OriCell网站
  • 高脂造模Apoe KO小鼠,仅需980元/只,下单即送精美礼品
  • C-NKG小鼠可享买三送一

小小标准品,助力分子诊断更准确

分子诊断

分子诊断是指通过分子生物学的检测手段,检测患者体内基因结构或表达水平的技术。由于其检测速度快、灵敏度高和特异性强等特点,被广泛应用于血液筛查、 遗传性疾病、传染性疾病、肿瘤伴随诊断等领域。比如现今与我们息息相关的新冠核酸检测,就属于分子检测的应用实例。分子诊断的检测往往需要标准品,作为对照,校正系统误差,确保结果的准确性。下面就和大家分享分子诊断的背景知识和标准品的应用意义吧!

 

应用于分子诊断中的检测技术

分子诊断主要检测基因的序列结构和表达水平,主要的检测技术包括PCR、高通量测序、荧光原位杂交(FISH)、基因芯片等。其中,PCR与高通量测序等应用最为广泛。

 

PCR技术的原理是以样品DNA为模板,在聚合酶、引物和dNTP等扩增体系下复制出大量的子代DNA。第一代PCR通常在扩增后,采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测,一般需要结合一代测序才能对基因型做定性分析。第二代荧光定量PCR(Real-Time PCR),也叫做qPCR,在反应体系中加入荧光物用于指示反应进程,利用荧光信号的变化来监测扩增产物的变化,通过荧光曲线来判断结果,并可以借助Cq值和标准曲线来定量。第三代PCR 微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR, DDPCR)也用于定量分析,相比于二代PCR灵敏度更高,能测定基因拷贝数。其原理是将反应体系分为成千上万个纳升级的微滴,其中每个微滴或不含待检核酸靶分子,或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经过扩增后,再通过检测荧光信号,并根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例计算出模板数量。

 

二代测序由于通量高,在检测多个样品和多个位点时,能节省时间、降低成本,所以在分子诊断中有巨大的应用潜力。其原理是通过模板DNA 分子的化学修饰,将其锚定在纳米孔或微载体芯片上,利用碱基互补配对原理,在 DNA 聚合酶链反应或 DNA 连接酶反应过程中,通过采集荧光标记信号或化学反应信号,实现碱基序列的解读,一次性可完成几十万至上百万条序列的测定。

 

分子诊断的应用领域

分子诊断的应用场景很多,如今主要应用的领域有无创产前检测(NIPT)、伴随诊断、肿瘤早筛和传染病检测等。

 

NIPT是通过高通量测序等手段,检测母体内的胎儿遗传信息,判别胎儿是否患染色体异常疾病,包括21 三体综合征(唐氏综合征)、18 三体综合征(爱德华氏综合征)、13 三体综合征 (帕陶综合征)。NIPT具有检测准确率高、周期短、漏诊率低和对母体损害低等优点。

 

伴随诊断是分子诊断的另一个应用领域。在使用分子靶向药前,需要先检测患者是否存在药物靶点,提高用药的准确性。常用的检测方法有PCR、NGS、FISH和免疫组化(IHC)等,其中PCR测序是常用的检测手段,具有快捷准确等特点。

分子诊断

表1. 分子诊断各技术在伴随诊断中的应用特点。

 

在肿瘤早筛中也会应用到分子诊断技术。肿瘤形成的其中一个重要原因是基因突变。因此尽早筛查出这类人群,开展预防和治疗是很重要的。现阶段多通过内镜、组织活检等手段检测,但操作麻烦、准确性不高且存在漏筛。而基于 PCR、NGS 等分子诊断技术的液体活检则具有很大的应用潜力,其原理是通过检测从转移灶释放到血液中的肿瘤细胞或者DNA。具有取样方便、灵敏度高、非侵入性、有效应对肿瘤异质性、在疾病发展的不同阶段可重复取样等优势。

 

分子诊断在传染病筛查的应用主要体现在新冠检测和血液筛查。在新冠筛查中,主要应用qPCR检测,能快速准确地筛查出感染者,是减少新冠传播的有力手段,具有精准度高和辨识度强等特点。血液筛查是为了确保血液制品的质量、避免交叉污染和保护工作人员的安全,防止相关疾病的感染者进入供血队伍。这些疾病包括:人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV)、梅毒螺旋体、丙氨酸氨基转移酶(ALT)等。早期以酶免检测(ELISA 技术)为主,但是灵敏度低。而以 PCR 技术为主的核酸检测(NAT)具有更高的灵敏性和特异性,能显著降低输血感染病毒带来的风险。

 

标准品在分子诊断中的应用

分子诊断的流程具有多个环节,从样品样本提取到变异检测,每个环节都存在不确定因素和不可规避的系统误差,这使得分析结果存在假阳性或假阴性的可能。因此需要标准品,来检测与校对分析体系的准确性。

 

分子诊断标准品应该具备以下3个特征:

1.  代表性。标准品需要与待测样品在基因遗传背景、细胞类型、组织类型和处理方式等方面高度相似,才能模拟待测样品的检测过程,以分析实验体系的精准度和判别待测样品结果。

 

2. 可量化。标准品需要具备突变频率阶梯性,将编辑细胞与野生型细胞以不同比例混合,用于模拟不同疾病或检测系统的检测上下限。

 

3. 持续稳定。标准品需要能持续且稳定生产。

 

在PCR检测变异的流程中,可以用标准品来验证试剂盒的提取效率、变异检测的准确度、试剂盒的灵敏度等。在核酸提取步骤中,样本经过不同的处理往往对核酸提取率有影响,比如经过福尔马林、石蜡包埋等处理等。如果存在与患者样本处理方式、材质、细胞复杂性和结构特性相似的标准品,例如FFPE标准品,则可以在提取环节中得知提取效率。如果更换提取体系时,只要使用相同的标准品,还可以比较不同提取体系的提取效率。同理,标准品在文库构建阶段和测序阶段也发挥着相同的作用,用于确定建库效率和测序质量。

 

生信分析位点变异情况时,由于标准品的突变位点、突变基因型和突变频率等信息都是通过人为修饰且已知,所以如果信息分析流程得出的变异检测结果与此不符,就需要调整参数,以得到准确的分析体系,同时还能准确判断患者样品的实际变异情况。

 

点突变细胞在分子诊断中的应用

基因点突变通常指单个碱基的替换或插入缺失。随着CRISPR-Cas技术的发展与应用,不管是基于同源重组(HDR)或单碱基编辑系统的基因点突变修饰变得更加容易实现。全球有超过50000种人遗传疾病,其中大部分是由基因组的点突变引起的。例如罕见病,点突变引起的占了50%。对于这些疾病的分子诊断就显得更为重要。同样的,这些基因点突变疾病的分子诊断也会面临上述的问题:需确保分析体系的准确性。此时以点突变细胞作为分子检测的标准品,便可以解决。

 

小结

随着精准医疗的概念不断深入人心,分子诊断越来越贴切我们的生活,同时由于技术的不断发展,PCR、高通量测序等技术的灵敏度、精确性和成本都不断再改善,促使分子诊断行业快速发展。但由于检测系统存在不可消除的系统误差或不确定因素,检测结果可能出现假阳性或假阴性。那么设置分子诊断标准品,消除系统误差则显得十分重要。

 

Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统 助力分子诊断标准品开发

分子诊断

赛业生物基于多年成熟稳定的体外细胞中的CRIPSR基因编辑技术,采取更有效的设计方案,高同源重组效率和无随机插入细胞基因组的风险,可轻松搞定各种细胞系的基因点突变,助力分子诊断标准品的开发。此外春季订购敲除细胞株,享最低6.7折优惠,低至1.66万元!欢迎拨打400-680-8038咨询订购!

如果您对产品或服务有兴趣,可通过以下方式联系我们
在下方表单
填写需求描述给我们
点击页面右侧“在线咨询”
工具快速咨询
拨打免费电话:
400-680-8038
发送邮件至邮箱:
info@cyagen.com
click to refresh
交流社区
神经
扫码加入
神经领域交流群
需备注来意,审核后进入
基因
扫码加入
基因领域交流群
需备注来意,审核后进入
细胞
扫码加入
细胞领域交流群
需备注来意,审核后进入
云课堂
扫码加入
云课堂交流群
需备注来意,审核后进入