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CAR-T细胞治疗临床前药理学模型知多少

CAR-T细胞治疗

近日,FDA批准了传奇生物和强生合作研发的CAR-T细胞治疗产品Carvykti,用于治疗复发性/难治性多发性骨髓瘤。作为全球第二款治疗多发性骨髓瘤的CAR-T产品,Carvykti对标由BMS和蓝鸟生物合作研发的Abecma。临床数据显示,Carvykti的客观缓解率(ORR)为97.9%,完全缓解率(sCR)为78.4%[1];Abecma的ORR为72%,sCR为28%[2]。从数据上看,Carvykti的疗效优势明显。Carvykti从首次获得临床试验批准到最终上市耗时接近4年的时间,而且临床前研究也耗费了大量的时间和精力。其间,临床前药物的有效性和安全性评价对于IND申报至关重要,本文将围绕CAR-T细胞治疗临床前的研究,为大家介绍几种药理学模型的选择。

 

体外模型

1肿瘤靶点过表达稳转株

CAR-T细胞的作用机制是通过CAR分子的scFv特异性识别肿瘤靶点抗原,然后进行杀伤。因此,人为构建出表达肿瘤抗原的细胞,可以用来检测CAR-T的杀伤能力。例如,使用慢病毒载体将CD19基因递送至293T细胞,构建CD19-293T过表达稳转株,使293T细胞表面过表达CD19抗原,进一步验证抗原表达阳性率,并用于后期验证实验。

CAR-T细胞治疗

图1. CD19-293T细胞CD19抗原阳性率检测。图源:赛业生物。

 

除了人为构建的肿瘤细胞模型,自然表达抗原的肿瘤细胞系也被用来检测CAR-T细胞的杀伤能力。杀伤效果的检测实验一般会用到流式细胞术、荧光素酶酶法、铬释放试验等。因此相应的,也可以构建:

 

荧光素酶稳转株

例如,诺华公司在2018年发表的靶向BCMA的CAR-T研究中,就使用了荧光素酶法[3]。荧光素酶可以催化荧光素氧化,在荧光素氧化的过程中,会发出生物荧光。研究者们在人多发性骨髓瘤细胞KMS-11中引入萤火虫荧光素酶(Luc)基因,构建出KMS-11-luc细胞,然后将CAR-T细胞和KMS-11-luc细胞按不同的效靶比(E:T ratio)共孵育20小时,检测细胞混合液的荧光强度,可以代表剩余的靶细胞数量。

CAR-T细胞治疗

图2. 使用荧光素酶法绘制的肿瘤细胞裂解曲线[3]

 

51Cr放射性标记的肿瘤细胞

2015年,在宾大和诺华的一项共同研究中,使用了铬释放法来检测CAR-T细胞的杀伤能力[4]。首先使用同位素51Cr标记U87 胶质瘤细胞,然后将CAR-T细胞与肿瘤细胞按不同的效靶比共孵育,肿瘤细胞被裂解后,51Cr从细胞中释放至上清液,检测上清液51Cr的含量,可以代表裂解的肿瘤细胞的数量。

CAR-T细胞治疗

图3. 使用铬释放法绘制的肿瘤细胞裂解曲线[4]

 

2Jurkat报告细胞系统

除了肿瘤细胞模型外,也可以用Jurkat报告细胞代替从PBMC分离并活化出的T细胞,来进行早期的评估试验。Jurkat细胞是人类T淋巴细胞的永生细胞系,最初在1970年代后期,从一名患有T细胞白血病的14岁男孩的外周血中建立的。在CAR-T的体外试验中,Jurkat细胞常被用于T细胞信号传导的研究。

 

纪念斯隆-凯特琳癌症中心在2019年的文章中,为了研究CAR-T细胞是否具有抗原依赖性,将红色荧光蛋白(RFP)基因递送至Jurkat细胞CD3ζ信号传导的下游区,同时在CAR分子上表达绿色荧光蛋白(GFP),构建出CAR/GFP修饰的Jurkat-RFP报告细胞[5]。绿色荧光代表CAR分子转导成功,而红色荧光代表CAR信号被成功传导。研究者们将CAR/GFP修饰的Jurkat-RFP报告细胞与表达抗原的靶细胞、不表达抗原的对照细胞分别共孵育,在不表达抗原的对照组中,如果同时有绿色荧光和红色荧光,则说明该类别的CAR-T细胞不具备抗原依赖性,即不是理想的CAR-T细胞。

CAR-T细胞治疗

图4. 使用流式细胞术检测CAR/GFP修饰的Jurkat-RFP报告细胞的荧光表达(纵坐标:绿色荧光;横坐标:红色荧光)[5]

 

体内模型

1动物肿瘤模型

 

在CAR-T治疗的临床前研究中,动物肿瘤模型的药效评价尤为重要。由于小鼠基因组与人类基因组的相似程度高,并且小鼠模型的构建成本低,因此小鼠成为了研究人类疾病的最佳实验模型。而免疫缺陷小鼠对外来移植物的排斥弱,非常适合动物肿瘤模型的构建。目前国际上公认的免疫缺陷程度最高的小鼠是具有Prkdc和Il2rg基因缺陷的小鼠,这两种基因的突变使小鼠的T细胞、B细胞和NK细胞的活性完全丧失。例如由赛业自主研发的C-NKG重度免疫缺陷小鼠(NOD/Shi-Prkdcscid Il2rgem1/Cgen),在NOD/Shi-scid背景品系上敲除Il2rg基因,拥有补体活性降低、巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱、树突状细胞功能下降、无T细胞和B细胞泄漏等特性,适合用于CDX和PDX模型的构建、免疫系统人源化小鼠模型的制备、GvHD模型构建和肿瘤免疫相关的研究。

 

除了重度免疫缺陷小鼠,裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠也可以用于肿瘤模型的构建。裸鼠(Nude小鼠)是上世纪60年代在英国发现的第一个免疫功能障碍小鼠;重度联合免疫缺陷小鼠(Server Combined Immune-Deficiency, SCID)具有Prkdc突变,表现为T细胞和B细胞缺失;NOD/SCID小鼠由非肥胖糖尿病(NOD)小鼠和SCID小鼠杂交产生,免疫缺陷程度进一步提高。随着生物科技的不断发展与进步,免疫缺陷动物也在被不断地优化和迭代。选择合适的免疫缺陷动物,可以在实验中取得更加优秀的成果,助力相关领域的研发。

 

肿瘤细胞系异种移植模型(Cell Line-Derived Xenograft, CDX)是将肿瘤细胞系移植到同种或异种动物体内形成肿瘤。肿瘤细胞系移植肿瘤保持着原发肿瘤的大部分生物学特性,成瘤效率高,实验周期短,因此很适合用于肿瘤药物的早期药效评价。在CAR-T治疗的研究中,使用含有荧光素酶基因的肿瘤细胞构建CDX模型,可以通过荧光监测肿瘤细胞的生长以及CAR-T细胞的抗肿瘤活性。

 

人源肿瘤组织异种移植模型(Patient-Derived Xenograft, PDX)是直接用患者新鲜肿瘤组织接种于免疫缺陷小鼠建立的模型。肿瘤组织在小鼠体内环境生长并传代2-3次,可以更好地表现亲代肿瘤性状,并且维持了肿瘤的异质性。与CDX模型相比,PDX模型最大的优势是保留了亲本肿瘤的异质性和组织学特性,例如细胞形态、血管系统、基质形态等,模拟了肿瘤发生的体内环境。

CAR-T细胞治疗

图5. PDX模型的构建流程[6]

 

同源移植模型(Syngeneic model)是将同种背景来源的肿瘤细胞系接种至免疫健全的近交系小鼠。受体小鼠拥有完整的鼠源免疫系统,具有完全的免疫活性,且该免疫系统与同种移植肿瘤组织相容,能最大化模拟肿瘤微环境的真实生活情况,缺点是移植的小鼠组织可能无法完全代表临床情况下人类肿瘤的复杂性。

 

人免疫系统重建动物模型(Human immune system-engrafted models, HIS)是通过异种移植人类免疫细胞或组织和/或其祖细胞到免疫缺陷小鼠中产生的。这类小鼠可以更有效地模拟人体免疫应答,为肿瘤免疫、自身免疫性疾病,以及人特异性传染疾病(例如由人类免疫缺陷病毒HIV引起的获得性免疫缺陷综合征AIDS)的转化研究提供了优秀模型。

 

2荧光素酶稳转株与动物肿瘤模型联合应用

与体外模型构建表达荧光素酶的肿瘤细胞的原理一致,体内模型中,也是利用荧光素氧化发光的特性,通过活体成像仪,监测体内肿瘤的大小、分布,并通过平均荧光强度(FMI)量化肿瘤的生长。例如构建急性淋巴细胞白血病的CDX模型时,可以将荧光素酶基因递送至人急性淋巴细胞白血病细胞Nalm6,构建Luci-Nalm6细胞。将不同剂量的Luci-Nalm6接种至C-NKG和NOG小鼠中,第21天的活体成像如下图所示。

CAR-T细胞治疗

CAR-T细胞治疗

图6. 活体成像检测Luci-Nalm6细胞异种小鼠肿瘤模型肿瘤生长情况(上:第21天活体成像检测;下:平均荧光强度)。来源:赛业生物。

 

赛业生物细胞治疗一站式解决方案 助力CAR-T细胞治疗临床前研究

 

在CAR-T的临床前研究中,细胞模型、动物模型、建模模型的选择都至关重要,明确研究的目的,建立有效的实验模型和方案,会使研究事半功倍。赛业生物提供细胞治疗一站式服务,从抗体筛选到稳转株构建,从建立细胞/动物模型到药效学评价,更好地加速CAR-T及细胞治疗研发进程。如有需要,欢迎联系我们咨询~

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