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揭示衰老相关克隆性造血分子的机制——DNMT3A突变
克隆性造血属于血液肿瘤的癌前病变状态，越来越多的研究发现，克隆性造血会随着个体的衰老而不断加剧，因而也被称为衰老相关克隆性造血。克隆性造血的个体发生白血病的风险较正常人增加了10倍，并出现髓系细胞分化偏向性，从而导致系统性慢性炎症，进而使得炎症相关疾病如动脉粥样硬化、心肌梗死以及中风的发生率提高了约1倍[1-3]。而全身性的慢性炎症反过来加剧克隆性造血的进展，从而形成一个恶性循环（图1）。
克隆性造血发生率随着年龄增大而增加，并伴随着很多关键基因的突变，其中DNMT3A在多个研究中都显示为突变频率最高的基因[4]。DNMT3A可测到的突变位点多达190个，其中R882位点突变在克隆性造血个体中占17%，在急性髓系白血病（AML）个体中占比高达50%[5]。由于克隆性造血为白血病的癌前病变状态，由此说明携带R882突变的克隆性造血患者更容易转化为白血病[6,7]。那么，DNMT3A突变频率随着衰老不断增加的分子机制尚不明确。
图1 克隆性造血、慢性炎症和心管疾病之间的联系
2022年2月，清华大学药学院王建伟团队在药学专业期刊《Acta Pharmaceutica Sinica B》发表题为“Aging-elevated inflammation promotes DNMT3A R878H-driven clonal hematopoiesis”的研究论文。王建伟实验室2017级博士研究生廖敏为这篇文章的独立第一作者，王建伟研究员和浙江大学第一附属医院的姜虹博士为共同通讯作者，这项研究发现炎症衰老环境下DNMT3A R878H（人类等位基因：DNMT3A R882H）细胞中细胞程序性坏死信号传导受到损害，R878H HSC重建血液系统能力增强，从而促进衰老骨髓中R878H驱动的克隆造血，增加血液系统疾病发生风险。
研究材料
在这项研究中，研究人员使用了Dnmt3afl-R878H/+小鼠（由赛业生物提供）、Vav-iCre小鼠、Mlkl-/-小鼠、Ripk1K45A小鼠、Ripk3Δ/Δ小鼠、CD45.1小鼠以及CD45.1/2小鼠。
技术方法
本项研究主要采用了流式分析、流式分选、全骨髓竞争移植、LPS炎症模型、体外培养造血干及祖细胞、细胞因子芯片检测、蛋白质印迹以及实时定量PCR研究方法。
技术路线
研究结果
1.衰老的骨髓促进DNMT3A R878H驱动的克隆性造血
研究者从年轻的R878H小鼠（即Dnmt3afl-R878H/+, Vav-icre+，其中Dnmt3afl-R878H/+小鼠由赛业生物提供，通过ES打靶技术构建）中提取骨髓细胞，连同正常的竞争者骨髓细胞移植到年轻与年老的受体小鼠中。结果显示，R878H骨髓细胞在年老受体小鼠中重建率更高，而WT细胞则没有明显差异（图2），说明年老的骨髓微环境促进了R878H诱导的克隆性造血。那么到底是年老骨髓中什么因素促进了R878H细胞的克隆性扩增呢？
图2 衰老的骨髓促进DNMT3A R878H驱动的克隆性造血
2.LPS诱导的慢性炎症促进R878H驱动的克隆性造血
近些年来，普遍认为衰老与炎症密切相关，因此有了炎性衰老（Inflamm-aging）的概念。那么，R878H细胞在年老骨髓中的克隆性扩增是否与年老的骨髓炎症微环境增强相关呢？为此，研究者分别用LPS模拟急性和慢性炎症刺激。发现R878H HSC对于急性炎症刺激的响应明显下降，而慢性炎症刺激可以促进R878H细胞驱动的克隆性造血（图3）。
图3 LPS诱导的慢性炎症促进R878H驱动的克隆性造血
3.R878H HSC抵抗TNFα诱导的细胞损伤
研究者分别取年轻和年老受体小鼠的骨髓上清做细胞因子芯片分析，发现其中TNFα信号通路在年老骨髓中显著上调。进一步研究发现，R878H HSC可以抵抗TNFα诱导的细胞损伤（图4），证明TNFα是年老骨髓微环境中促进R878H细胞克隆性扩增的主要炎症因子。
图4 R878H HSC抵抗TNFα诱导的细胞损伤
4.Dnmt3a R878H细胞抵抗细胞程序性坏死激活
研究者将年老受体骨髓中的LSK细胞分选出来做RT-PCR，分别检测TNFα信号下游相关的通路基因的表达，发现凋亡通路的Fadd和Caspase-8以及细胞程序性坏死通路的Ripk1和Ripk3表达下降（图5），说明凋亡和程序性坏死通路在R878H细胞中受到了抑制。进一步研究发现，R878H细胞能够部分抵抗细胞程序性坏死，而不是凋亡（图5），说明Dnmt3a R878H细胞通过抵抗细胞程序性坏死的激活而获得增殖优势。
图5 Dnmt3a R878H细胞抵抗细胞程序性坏死激活
研究结论
在这项研究中，研究者利用造血干细胞竞争性移植和LPS诱导的炎症模型来检测炎症和衰老微环境对DNMT3A R878H驱动的克隆性造血的作用，观察到R878H骨髓细胞在衰老的骨髓微环境和炎症侵袭时表现出增强的重建能力，发现R878H造血干及祖细胞通过抵抗由TNFα诱导、RIPK1–RIPK3–MLKL介导的细胞程序性坏死而促进R878H驱动的克隆性造血，而衰老上调的炎症信号（主要为TNFα信号）可以加速这一过程（图6）。
该研究系统性地从DNMT3A R878H小鼠模型的构建，到DNMT3A R882突变引发衰老相关克隆性造血的机制研究，解析了衰老进程中DNMT3A hR882H/mR878H突变导致造血干细胞克隆性增生的分子生物学机制，对DNMT3A突变及其他相关突变驱动的克隆性造血及白血病研究具有一定的指导意义。
图6 Dnmt3a R878H驱动克隆性造血模型
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参考文献：
[1]Genovese G, Kähler A K, Handsaker R E, et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence[J]. N Engl J Med, 2014, 371(26): 2477-2487.
[2]Jaiswal S, Fontanillas P, Flannick J, et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes[J]. N Engl J Med, 2014, 371(26): 2488-2498.
[3]Jaiswal S, Natarajan P, Silver A J, et al. Clonal Hematopoiesis and Risk of Atherosclerotic Cardiovascular Disease[J]. N Engl J Med, 2017, 377(2): 111-121.
[4]Bick A G, Weinstock J S, Nandakumar S K, et al. Inherited causes of clonal haematopoiesis in 97,691 whole genomes[J]. Nature, 2020, 586(7831): 763-768.
[5]Brunetti L, Gundry M C, Goodell M A. DNMT3A in Leukemia[J]. Cold Spring Harb Perspect Med, 2017, 7(2).
[6]Miles L A, Bowman R L, Merlinsky T R, et al. Single-cell mutation analysis of clonal evolution in myeloid malignancies[J]. Nature, 2020, 587(7834): 477-482.
[7]Yang L, Rau R, Goodell M A. DNMT3A in haematological malignancies[J]. Nat Rev Cancer, 2015, 15(3): 152-165.
原文检索：
MinLiao, RuiqingChen, YangYang, et al. Aging-elevated inflammation promotes DNMT3A R878H-driven clonal hematopoiesis. Acta Pharmaceutica Sinica B. Volume 12, Issue 2, February 2022, Pages 678-691.https://doi.org/10.1016/j.apsb.2021.09.015
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