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广州医科大学团队揭示CD177+中性粒细胞在胆道闭锁中的作用

先天性胆道闭锁(BA)是一种常见的高致死率新生儿疾病,因胆管狭窄或阻塞而导致胆汁在肝脏内淤积,引起不可逆的肝脏损伤。通过手术可缓解胆汁淤积症状,但约有一半婴儿会继续出现肝病恶化,最终需要进行肝移植。胆道闭锁的发病机制仍不清楚,但中性粒细胞被认为在疾病进展中发挥作用。

 

最近,广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心的研究团队深入分析了CD177+中性粒细胞在胆道闭锁发病机制中的作用,发现CD177+细胞通过形成胞外诱捕网(NET)而在胆管上皮细胞损伤中发挥关键作用。

 

这篇题为“CD177+ cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia”的文章于7月发表在肝病学权威杂志《Journal of Hepatology》上。

 

CD177+中性粒细胞在胆道闭锁中的作用

 

研究材料与方法

在这项研究中,研究人员使用了BALB/c小鼠和NOD/SCID小鼠,并委托赛业生物构建了Cd177基因敲除(Cd177-/-)小鼠。作者采用单细胞RNA测序和Smart-Seq RNA测序方法获得了多个细胞的基因表达谱,并通过胆管造影术和组织切片染色等分析小鼠的胆管阻塞和肝脏损伤,同时还开展了一项初步的临床试验,以确定N-乙酰半胱氨酸对CD177+细胞积累和NET形成的影响。

 

技术路线

01建立胆道闭锁小鼠模型并鉴定Gr-1+细胞的主要成分

02构建Cd177基因敲除小鼠以明确CD177+细胞在胆道闭锁中的功能

03采用Smart-Seq RNA测序方法分析CD177+细胞的基因表达谱

04确定CD177+细胞通过形成NET而促进胆管上皮细胞凋亡

05分析NAC在胆道闭锁治疗中的安全性和有效性

 

研究结果

1.CD177+细胞在胆道闭锁患者中积累

之前的研究显示中性粒细胞在胆道闭锁患者的胆管周围积累,而且在小鼠疾病模型中,Gr-1+(中性粒细胞标志物)细胞的去除阻止了疾病的发生,表明中性粒细胞可能具有病理作用。由于Gr-1+细胞是一个混合群体,故需要进一步分析来明确各个成分的具体作用。

 

研究人员采用缺乏适应性免疫系统的NOD/SCID小鼠,通过腹腔注射恒河猴轮状病毒(RRV)构建出胆道闭锁小鼠模型。作者发现,与对照组相比,RRV组小鼠肝脏中的Gr-1+细胞升高,表明Gr-1+细胞可能是对病毒感染做出应答并介导胆管损伤的主要先天免疫细胞群。

 

作者接着用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术分析了该群Gr-1+细胞的组成。基因表达谱显示细胞表面分子CD177在Gr-1+细胞群中高表达,表明CD177+细胞是Gr-1+细胞的主要功能亚群,同时干扰素刺激相关基因和中性粒细胞脱颗粒相关基因的表达也显著上调。这些数据表明,在新生小鼠感染RRV后,CD177+细胞被激活并表现出强烈的抗病毒反应。作者还发现,胆道闭锁患者外周血和肝脏活检样本中的CD177+细胞数量显著高于对照组。

 

为了进一步确定CD177+细胞在胆道闭锁中的功能,研究人员委托赛业生物构建了Cd177基因敲除(Cd177-/-)小鼠,并与野生型小鼠进行了比较。与对照组相比,Cd177-/-小鼠表现出疾病发作延迟以及发病率和死亡率降低。胆管造影显示Cd177-/-小鼠的肝外胆管没有阻塞。这些结果显示CD177+细胞在小鼠胆道闭锁的发病机制中起主要作用。

 

2.CD177+细胞通过NET促进BEC凋亡

之后,作者又采用Smart-Seq RNA测序方法分析了CD177+细胞的基因表达谱,发现BA患者来源的CD177+细胞中与线粒体和中性粒细胞相关的信号通路是两条主要的上调通路。值得一提的是,参与氧化磷酸化和氧化应激基因表达的上调,表明线粒体功能的激活与CD177+细胞的强大免疫功能之间存在密切关联。

 

之前的研究发现,CD177+细胞的积累与多种自身免疫性疾病有关。不过,当炎症性肠病发生时,CD177+细胞通过释放IL-22和胞外诱捕网(NET)发挥保护作用。NET是由染色质DNA和多种效应蛋白组成的3D结构,可以捕获和杀死病原体,也可能导致组织和细胞损伤。

 

研究人员发现,分离自胆道闭锁患者的CD177+细胞与胆管上皮细胞(BEC)共培养时会诱导后者凋亡;而将不同的NET抑制剂添加到CD177+细胞培养物中,收集上清液并作为条件培养基添加到胆管上皮细胞中,则发现NET抑制剂可减少胆管上皮细胞凋亡(图1)。这些结果表明,在胆道闭锁发生时,CD177+细胞可通过释放NET诱导胆管上皮细胞凋亡。

 

CD177+中性粒细胞在胆道闭锁中的作用

图1 胆道闭锁患者的CD177+细胞通过NET促进胆管上皮细胞凋亡

 

3.NAC可降低BA患者体内CD177+细胞数量和活性氧(ROS)水平贴片的体内测试

最后,研究人员测试了NET抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC,ROS清除剂)对胆道闭锁患者的CD177+细胞数量和NET形成的影响。作者发现,患者外周血内的CD177+细胞数量和ROS水平在NAC治疗后显著降低,且线粒体活性和NET形成也降低。RNA-seq分析发现,NAC处理下调了CD177表达并增加了RASA4表达。以上的结果证实,NAC可降低CD177+细胞的数量和表达,有望改善胆道闭锁患者的病理状况。

 

研究结论

 

CD177+中性粒细胞在胆道闭锁中的作用

 

总的来说,这项研究解析了先天免疫在胆道闭锁形成中的作用。CD177+细胞通过NET形成和线粒体积累来诱导胆管上皮细胞损伤,而N-乙酰半胱氨酸治疗可降低CD177+细胞数量和活性氧水平从而抑制NET形成,有助于胆道闭锁的管理。

 

原文检索:

Zhang R, Su L, Fu M, et al. CD177+ cells produce neutrophil extracellular traps that promote biliary atresia. J Hepatol. 2022 Jul 5:S0168-8278(22)00409-3. doi: 10.1016/j.jhep.2022.06.015.

 

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