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Blood文献前沿：徐州医科大学团队发现血小板功能和动脉血栓调控的新机制
蛋白磷酸化和去磷酸化在调节细胞内信号事件中发挥着重要作用，此过程主要由蛋白酪氨酸激酶（PTK）和酪氨酸去磷酸酶（PTP）所调控[1]。在血小板受刺激时，PTK发生磷酸化进而启动血小板活化信号，而PTP使磷酸化蛋白去磷酸化以下调血小板功能，阻止其进一步活化[2,3]。PTPN22（protein tyrosine phospha- tase，nonreceptor type 22）在造血细胞中表达，是一种负调控T细胞信号的蛋白酪氨酸磷酸酶，通过去磷酸化T细胞信号通路的关键激酶来抑制T细胞抗原受体（TCR）信号。
2022年9月，徐州医科大学血液病研究所乔建林团队在血液学领域顶级期刊Blood发表题为“Protein tyrosine phosphatase PTPN22 negatively modulates platelet function and thrombus formation”的研究论文，研究了PTPN22在血小板中的表达及其作用，揭示了血小板功能和动脉血栓调控的新机制。研究生王霞敏、魏光玉和丁洋洋是论文的共同第一作者，乔建林教授、徐开林教授和曾令宇教授为共同通讯作者。
研究材料
PTPN22-/-小鼠（由赛业生物提供）、野生型小鼠
技术方法
流式细胞术、动脉血栓模型，深静脉血栓模型、出血模型、蛋白印迹、免疫共沉淀、定量磷酸化蛋白组学、蛋白体外表达及纯化、体外去磷酸化检测等。
技术路线
01PTPN22-/-和WT小鼠
02体内出血和血栓形成模型
03体外血小板功能检测分析
04磷酸化蛋白组学探索PTPN22潜在底物
05体外分析验证组学的结果
研究结果
1.血小板表达PTPN22，且其缺失促进血小板参与体内止血和血栓形成
研究者首先在人和小鼠血小板及巨核细胞均检测到了PTPN22（图1）。利用PTPN22基因敲除小鼠（该小鼠由赛业生物提供），发现PTPN22敲除显著增强血小板参与体内止血和动脉血栓形成。体外flow chamber实验也验证PTPN22敲除血小板的粘附和体外血栓形成显著增强。
图1 PTPN22在血小板和巨核细胞中的表达及在止血和血栓中的作用
2.PTPN22敲除显著增强血小板聚集、颗粒释放、aIIbb3活化和钙动员
为探索PTPN22对体外血小板功能的影响，研究者分离血小板，使用不用激活剂来刺激血小板，结果发现PTPN22缺失显著促进体外血小板聚集，颗粒释放、aIIbb3活化及钙离子动员（图2）。
图2 PTPN22对血小板聚集、颗粒释放、aIIbb3活化及钙动员的影响
3.PTPN22缺失显著促进血小板铺展和血块收缩
为分析PTPN22对整合素aIIbb3“由外向内”信号转导的影响，研究者进行了血小板铺展和血块收缩实验。结果发现：PTPN22敲除的血小板在胶原或纤维蛋白原上的铺展能力显著增强，同时凝血酶诱导的血块收缩也显著加快（图3）。
图3 PTPN22对血小板铺展和血块收缩的影响
4.PTPN22敲除影响血小板活化后众多蛋白的磷酸化
为探索PTPN22参与调控血小板功能的分子机制，研究者进行了定量磷酸化蛋白组学分析，发现PTPN22敲除引起血小板内众多蛋白磷酸化水平的差异（图4）。通过比较WT和PTPN22敲除血小板活化后的磷酸化肽段，发现9个上调的磷酸化肽段和18个下调的。由于PTPN22敲除引起血小板活性增加，为此研究者重点关注了9个上调的磷酸化肽段。进一步分析发现，9个磷酸化肽段中只有PDE5A的磷酸化与血小板功能相关，为此，接下来实验选择PDE5A作为研究对象。
图4 定量磷酸化蛋白组学分析
5.PTPN22敲除上调PDE5A磷酸化
为验证磷酸化蛋白组学结果，研究者检测了体外血小板经刺激后PDE5A的磷酸化，发现PTPN22敲除血小板内PDE5A磷酸化显著高于WT血小板。此外，PTPN22敲除后显著降低了负向调控血小板功能的cGMP水平和VASP的磷酸化（图5）。此外，研究者发现使用PDE5A抑制剂可逆转PTPN22敲除后引起的血小板高反应性。
图5 PTPN22敲除后引起PDE5A磷酸化水平的增加
6.PTPN22与磷酸化PDE5A结合并使其去磷酸化
为进一步探索PTPN22与PDE5A的关系，研究者进行了CO-IP实验，发现血小板活化后PTPN22与磷酸化PDE5A结合（图6），通过体外表达纯化PTPN22活性片段和使用磷酸化肽段，研究团队发现PTPN22可使磷酸化的PDE5A的Ser去磷酸化，且其去磷酸化活性显著高于Tyr去磷酸化。
图6 PTPN22与磷酸化PDE5A结合并使其去磷酸化
7.抑制人PTPN22可显著增强人血小板功能
为验证PTPN22是否在人血小板发挥相同作用，研究者使用了PTPN22抑制剂LTV-1，结果发现抑制人血小板PTPN22显著增强血小板聚集能力、铺展和血块收缩及上调PDE5A磷酸化（图7），与小鼠结果一致。
研究结论
在本项研究中，通过利用PTPN22基因敲除小鼠，研究者系统性分析了PTPN22在血小板功能和血栓形成中的作用及其分子机制。首次证明了PTPN22在血小板功能和动脉血栓形成中的新作用，确定了未来预防血栓或心血管疾病的新潜在靶点。
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参考文献：
1. Xu Y, Fisher GJ. Receptor type protein tyrosine phosphatases (RPTPs)— roles in signal transduction and human disease. J Cell Commun Signal. 2012;6(3):125-138.
2. Senis YA. Protein-tyrosine phosphatases: a new frontier in platelet signal transduction. J Thromb Haemost. 2013;11(10):1800-1813.
3. Faria AVS, Andrade SS, Peppelenbosch MP, Ferreira-Halder CV, Fuhler GM. The role of phospho-tyrosine signaling in platelet biology and hemostasis. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2021;1868(3):118927.
4. Wang X, Wei G, Ding Y, et al. Protein tyrosine phosphatase PTPN22 negatively modulates platelet function and thrombus formation. Blood. 2022;140(9):1038-1051.
原文检索：
Xiaofei Zhang, Tingting Cong, Lei Wei, et al. YTHDF3 modulates hematopoietic stem cells by recognizing RNA m6A modification on Ccnd1. Haematologica Early view Feb 3, 2022
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