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郑州大学团队Nature子刊发文,揭秘肺癌的化疗耐药性

肺癌是造成全球癌症死亡的主要原因。化学疗法、放射疗法、靶向生物疗法以及近年来的免疫疗法是肺癌患者的主要治疗选择,但肿瘤与基质成纤维细胞间的某些相互作用会引起肺癌的化疗耐药性,导致癌症复发和转移。因此,了解成纤维细胞与肿瘤之间的通讯无疑将有助于肺癌治疗的改善。

 

近日,郑州大学第一附属医院医学研究中心的研究团队发现,锌转运蛋白ZIP1阳性(ZIP1+)的成纤维细胞通过间隙连接直接与肿瘤细胞相互作用,并导致肺癌化疗耐药。这项研究成果于10月7日发表在《Nature Communications》杂志上,对肺癌化疗的改善具有重要意义。

 

肺癌的化疗耐药性

图片来源:Nature Communications

https://www.nature.com/articles/s41467-022-33521-4

 

研究材料与方法

在这项研究中,研究人员使用了小鼠肺癌细胞系LLC和人肺癌细胞系A549和H1299,并分离了人癌症相关成纤维细胞(hCAF),同时也使用了ZIP1缺陷型小鼠(由赛业生物提供)和异位移植小鼠肿瘤模型。此外,作者采用单细胞RNA测序对基质细胞进行分选,并开展了基因集变异分析(GSVA)和RNA速率分析,最后通过FACS测定了细胞内的Zn2+,以及Zn2+的吸收和转移。

 

技术路线

01 通过scRNA-seq分析CAF在化疗后的适应性,发现Zip1在一个亚群在高水平表达

02 分析ZIP1的表达是否影响间隙连接的形成,发现ZIP1+ CAF与肺癌细胞形成间隙连接

03 ZIP1+成纤维细胞作为Zn2+储备库,通过间隙连接将Zn2+转移至癌细胞中

04 Zn2+诱导ABCB1介导的药物排出,促进肺癌的化疗耐药

05 ZIP1+成纤维细胞与肺癌患者的化疗耐药具有临床相关性

 

研究结果

1.ZIP1+成纤维细胞与肺癌细胞形成间隙连接

癌症相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts, CAF)是异质性的基质细胞,与肺癌化疗耐药有关。之前的研究发现,成纤维细胞可以直接与肿瘤细胞连接,导致其转移。还有报道称,CAF可能与肺癌细胞形成间隙连接(gap junction),以交换代谢物。然而,在化疗过程中,间隙连接如何调控成纤维细胞与癌细胞之间的通讯,目前还不大清楚。

 

在这项研究中,研究人员使用异位移植小鼠肿瘤模型,通过单细胞RNA测序分析CAF在化疗后的适应性,发现了一个成纤维细胞亚群高水平表达Zip1。锌转运蛋白ZIP1是溶质载体家族39(SLC39)中的一员,负责维持胞质的锌浓度。经过化疗药物阿霉素(DOX)处理后,小鼠肿瘤中的Zip1+ CAF细胞增加,而其他CAF亚群减少(图1)。

 

肺癌的化疗耐药性

图1 scRNA-seq显示DOX处理后Zip1CAF细胞在肿瘤中富集[1]

 

接下来,作者分析了ZIP1在成纤维细胞中的表达是否影响间隙连接蛋白的表达。结果显示,ZIP1在hCAF中的过表达增加了间隙连接蛋白43(CX43)的表达。相反,小鼠胚胎成纤维细胞中Zip1的敲低则降低了CX43的表达。与Zip1+/-和Zip1-/-小鼠相比,Zip1+/+小鼠也表达更高水平的CX43(实验所用Zip1缺陷小鼠由赛业生物提供)。

 

后续的分析显示,CAF上的CX43与肿瘤细胞中的CX43存在物理上的相互作用。荧光染料钙黄绿素可从成纤维细胞转移至肿瘤细胞,表明A549肿瘤细胞与hCAF之间形成功能性的间隙连接。在过表达ZIP1后,钙黄绿素转移更高效。这些结果表明,ZIP1+成纤维细胞通过上调CX43与肿瘤细胞形成有效的间隙连接。

 

2.ZIP1+成纤维细胞将Zn2+转移至癌细胞

考虑到Zn2+是ZIP1的底物,研究人员接下来探讨了在两种细胞之间运输Zn2+的可能性。结果显示,在DOX处理后,肿瘤间隙液中不稳定Zn2+水平增加,且在用DOX治疗的肿瘤中观察到大范围的坏死。进一步的分析显示,CAF能够吸收紫杉醇化疗处理的垂死癌细胞释放的Zn2+,并且吸收量与Zn2+的细胞外剂量成正比。此外,与hCAF共培养后,A549肿瘤细胞中的Zn2+增加,而庚醇(间隙连接的解偶联剂)或TPEN(Zn2+螯合剂)的预处理可以降低Zn2+梯度(图2)。研究人员认为,ZIP1+成纤维细胞可作为Zn2+储备库,通过间隙连接将Zn2+转移至癌细胞中。

 

肺癌的化疗耐药性

图2 ZIP1+成纤维细胞通过间隙连接将Zn2+转移至癌细胞[1]

 

在后续的分析中,作者发现CAF中的Zn2+以剂量依赖性方式刺激CX43的上调和pAKT的激活。同时,Zn2+刺激又导致肿瘤细胞中的CX43表达以时间依赖性和剂量依赖性的方式升高。这些结果显示,源于成纤维细胞的Zn2+通过上调癌细胞中的CX43进一步促进间隙连接的形成。

 

3.ZIP1+成纤维细胞促进肺癌的化疗耐药

那么,Zn2+对于肿瘤对药物的应答有何影响?研究人员发现,肺癌细胞与CAF细胞的共培养诱导肿瘤细胞表达ABCB1。ABCB1是一种多药耐药蛋白,可将多种药物(包括DOX)排出细胞外,使得肿瘤细胞产生耐药性。随后用紫杉醇和TPEN联合处理肿瘤细胞。在加入低水平的TPEN后,肿瘤对紫杉醇的敏感性显著增加。同时,Zn2+刺激ABCB1表达并降低DOX在肿瘤细胞内的积累。由此可见,Zn2+诱导ABCB1介导的药物排出,并保护肿瘤细胞免受药物毒性。

 

接下来,作者探讨了ZIP1+成纤维细胞是否对癌细胞具有保护作用。与Zip1-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)相比,Zip1+/+MEF减弱了DOX诱导的肺癌细胞的DNA损伤。相应地,Zip1+/+MEF降低了肿瘤细胞中的DOX,并增加了ABCB1的表达。对于荷瘤小鼠,DOX在Zip1+/+小鼠肿瘤细胞内的积累显著低于Zip1+/-和Zip1-/-小鼠,而ABCB1在Zip1+/+小鼠肿瘤细胞内的表达也显著高于Zip1-/-细胞。这些结果表明,无论在体外还是体内,ZIP1在成纤维细胞中的表达都赋予了肺癌细胞耐药性。

 

最后,研究人员在90名接受化疗的肺腺癌患者队列中进一步研究了ZIP1+成纤维细胞与肺癌化疗耐药的临床相关性。他们发现,在大多数肿瘤中,ZIP1+成纤维细胞的比例超过50%。此外,ZIP1high成纤维细胞状态预示着总生存期和无进展生存期较差,表明ZIP1high成纤维细胞与肺腺癌的化疗耐药性存在关联。在另一组肺腺癌患者中,肿瘤细胞的ABCB1表达与CAF中的ZIP1表达呈正相关。这些结果都表明,ZIP1+成纤维细胞通过上调CX43与癌细胞相连接,并通过Zn2+转移来促进化疗耐药(图3)。

 

肺癌的化疗耐药性

                                               图3 ZIP1+成纤维细胞通过Zn2+转移来促进化疗耐药[1]

 

研究结论

总的来说,这项研究显示ZIP1+成纤维细胞与肺癌细胞之间通过CX43介导的间隙连接形成短距离的相互作用,并通过Zn2+转移形成化疗耐药性。这些结果对肺癌治疗具有重要意义,有望设计出克服化疗耐药性的策略。

 

原文检索:

[1]Ni, C., Lou, X., Yao, X. et al. ZIP1+ fibroblasts protect lung cancer against chemotherapy via connexin-43 mediated intercellular Zn2+ transfer. Nat Commun 13, 5919 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33521-4

 

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