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杜氏肌营养不良机理研究及有哪些小鼠模型?杜氏肌营养不良治疗方式有哪些?

发病机制

杜氏肌营养不良(DMD)是X染色体连锁遗传疾病,以进行性肌无力和消瘦为特征。DMD基因位于Xp21.2-3,主要作用是产生抗肌萎缩蛋白,抗肌萎缩蛋白缺乏易造成肌肉断裂及细胞内钙紊乱,从而导致肌肉坏死及细胞死亡;之后虽由周围的卫星细胞激活形成肌细胞再生,但最终也会因为卫星细胞的老化而使肌细胞再生停止,使肌肉组织最终被纤维脂肪浸润而失去肌组织功能。

 

DMD是容易发生突变的基因,且突变类型较多,包括小的缺失、插入、点突变及重复序列,或者是大片段的一个或多个外显子缺失或序列重复,其中大片段缺失发生率高,大约占已发现突变的70-80%。突变常发生的热点区域是外显子45-53之间,其次是外显子2-20。DMD基因突变类型的差异往往也反应在疾病的症状的差异。有的突变在读码框外,干扰了翻译读码框,造成抗肌萎缩蛋白缺失;而在读码框内的突变,往往翻译出的抗肌萎缩蛋白片段虽然不完整,但是具有一定的功能,患者的症状不严重,这种患者又被成为贝克肌营养不良症(BMD)。DMD基因突变类型多样,导致其临床表现各异,可能每种临床亚型所需的基因编辑策略不同[1]

 

动物模型

目前DMD尚无治愈方法,各种治疗手段大多处于试验研究阶段,因此相关动物模型的替代研究成为当前的一个重点问题。目前DMD动物模型最常用的是小鼠和犬。

 

mdx小鼠模型:

mdx鼠是最常用于探索抗肌萎缩蛋白基因表达和功能的小鼠模型。这种模型的23号外显子发生无义突变而导致终止密码子提前出现,导致基因的表达提前终止,造成所编码的蛋白缩短,由此引起全长抗肌萎缩蛋白的表达缺失。对7周龄mdx小鼠的胫骨前肌 (tibialis anterior, TA)进行抗肌萎缩蛋白的免疫荧光染色(图1-A)和HE染色(图1-B),结果显示mdx小鼠TA肌细胞内抗肌萎缩蛋白缺失,肌细胞皱缩,有较多中性粒细胞浸润。

 

杜氏肌营养不良机理研究

图1 mdx小鼠胫骨前肌(TA)肌营养不良蛋白丢失和肌肉损伤;A.肌营养不良的TA肌肉染色(比例尺=50μm);B.TA的HE染色(比例尺=50μm)

 

基因双敲除(double knock out, DKO)鼠模型:

为了使mdx小鼠的肌肉表型与DMD患者更加相似,研究人员在mdx小鼠上设计了几个额外突变,产生了DKO鼠。其中最常见的是抗肌萎缩蛋白基因与抗肌萎缩蛋白相关基因双敲除鼠,即mdx/utrm-/-鼠。这一鼠种呈现出较为严重的肌营养不良表型,表现为严重的肌肉无力、关节挛缩和脊柱后突,且其平均生存期仅为3个月,这反过来支持了抗肌萎缩蛋白相关蛋白对肌萎缩蛋白缺失有代偿作用的说法。而且,mdx/utrn-/-鼠在DMD基因治疗研究中是非常有用的,其表型在很大程度上可被抗肌萎缩蛋白相关蛋白在肌肉内特异性表达所缓解。

 

Dmdmdx大鼠模型:

有学者提出用大鼠作为DMD的研究模型。大鼠比一般的mdx小鼠在行为表现上更具特征,其运动协调性也更为精确。为了产生这种抗肌萎缩蛋白缺陷的大鼠,他们通过转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases)使大鼠DMD基因第23号外显子缺失。验证实验发现,Dmdmdx大鼠表现出与DMD患者相似的肌肉损害,并以骨骼肌重量减轻、肌纤维坏死、纤维大小多变为特征。此外,Dmdmdx大鼠还伴有进行性扩张型心肌病的表现,因而Dmdmdx大鼠对DMD心功能不全的研究也有重要意义。

 

犬类模型:

犬类模型亦可用于DMD的研究,相比其它哺乳动物模型肌营养不良金毛猎犬(golden retriever muscular dystrophy, GRMD)可以更好地模仿人类抗肌萎缩蛋白缺乏症。其包含一个抗肌萎缩蛋白基因突变,并表现出营养不良的肌肉损伤、炎症聚集、进展性的纤维化和脂肪浸润、早期运动损害等,最终可因呼吸或心脏衰竭而提前死亡。这些临床病理表现均与DMD患者极为相似,因而GRMD在DMD的治疗研究中具有一定价值[3]

 

治疗方式

对症治疗药物

Dystrophin蛋白缺失会导致一系列病理变化,包括肌肉萎缩、炎症、钙过载、氧化压力、组织缺血等。针对这些病理变化过程的相关药物治疗可以使所有患者获益,例如:

 

激素:是目前认为能够减慢DMD患者肌力和运动功能衰退的唯一药物,长期每日服用糖皮质激素能明显延缓患者病情进展。它的作用机制主要是通过抑制NF-κB通路抑制炎症,激活钙调磷酸酶NF-AT通路抑制肌坏死。目前强的松和强的松龙是最常用的激素治疗药物,美国FDA批准的地夫可特也可以用于DMD,且副作用更小。近年来正在研发温和激素Vamorolone(VBP15),相对于传统激素,能以更小的副作用获得同等疗效。

 

除此之外还有:抑制NF-κB的药物、调节肌肉细胞中钙水平的药物、促进肌肉生长药物抗纤维化药物、针对无义突变的通读疗法。

 

物理治疗

适量的运动训练以及应用矫形支具可以刺激DMD患者肌肉蛋白质的合成,延缓呼吸衰竭,防止关节挛缩。近年来有研发虚拟现实 (VR)游戏训练方案以增加训练的趣味性,也有研发供DMD患者使用的机器人上肢外骨骼,是使DMD患者能够继续使用手臂功能的可移动设备。

 

杜氏肌营养不良机理研究

图2 适量运动训练(图片来自健康界)

 

基因治疗

基因替代治疗:

是在DMD患者的基因组中插入外源的功能性DMD基因,从而恢复DMD患者骨骼肌、心肌细胞表达有功能的抗肌萎缩蛋白(如图3)。但由于DMD基因大,腺相关病毒(AAV)装载容量有限,一般采用截短的微型DMD基因 (microdystrophin)。研究者在mdx小鼠模型中,局部注射缺少70%编码序列的微型Dys,可保护mdx小鼠的四肢肌肉和心脏功能。同样,在GRMD的犬模型中也实现了肌肉功能改善。但基因替代治疗不适用于体内含有抗AAV抗体的患者,这类患者约占所有DMD的50%,因对病毒衣壳有免疫反应,可能对微型Dys本身产生体液或细胞免疫反应,故这类病人禁止接受AAV基因疗法。目前,针对AAV介导的微型抗肌萎缩蛋白基因治疗正开展多项临床试验,也有研究通过双重腺相关病毒技术和慢病毒载体提高基因载体的容量,有望装载全长的DMD基因。

 

杜氏肌营养不良机理研究

图3 基因替代治疗原理示意图

 

外显子跳跃治疗:

是利用特异性反义寡核苷酸在DMD基因前信使RNA剪接过程中,排除特定外显子以重建阅读框,将突变类型纠正为整码突变,这样大多数DMD患者(见图4)在理论上可以产生截短的、但功能正常的Dys,是DMD治疗的又一策略(见图5)。FDA在2016年批准的eteplirsen是一种能够跳跃51号外显子的反义核苷酸,适用于大约13%的DMD患者治疗。使用etepliesen长期治疗能促进有功能的Dystrophin蛋白表达,延缓患者呼吸功能的下降,目前处于3期临床试验。外显子跳跃治疗也具有其局限性,例如转导不足、尤其是在心脏组织中,转导效率低下,组织摄入不稳定,需要频繁用药才能达到治疗效果。为进一步提高外显子跳跃治疗效率,对提高反义寡核苷酸的传递或吸收的研究正在进行。

 

杜氏肌营养不良机理研究

图4 DMD突变示意图

 

杜氏肌营养不良机理研究

图5 外显子跳跃治疗原理示意图

 

基因编辑治疗:

利用细胞自身的修复机制非同源末端链接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源重组(Homologous Recombination, HR)所致随机插入和 (或)缺失,在原基因座位修复突变基因。工程核酸酶可通过切割DNA双链结构的特定序列,诱发修复位点断裂,从而达到原位基因编辑的目的(见图6)。目前基因编辑治疗仍处于体外细胞和动物实验阶段,对于应用于人体的安全性和有效性还需进一步临床试验证实。基因组编辑是在DNA水平上进行的,因此被编辑基因产生的所有RNA转录本来都是自身产生的,理论上这就排除了重复治疗的需要;但基因编辑治疗不能完全预防与DMD相关的肌肉损伤,一旦发生大规模的肌肉损伤,多核纤维中前期已接受基因组编辑过的细胞核就会丢失。因此,患者仍有可能随着时间的推移,部分Dys水平逐渐下降。DMD基因组编辑治疗的长期有效性,还需进行长期的研究。

 

杜氏肌营养不良机理研究

图6 基因组编辑原理示意图

 

终止密码子通读治疗:

又称为无义突变通读治疗,一些化合物通过与核糖体的结合,阻止终止密码子的信号识别,从而跳过这个错误的终止密码子,诱导提早出现的终止密码通读,从而继续翻译Dys(见图7)。该方法适用于所有无义突变DMD患者,其占总患者人群的10%-15%。

 

杜氏肌营养不良机理研究

图7 终止密码子通读治疗原理

 

干细胞疗法

干细胞是一种具有自我复制能力并且可以分化成多种功能细胞的多潜能细胞。干细胞疗法是将自体或同种异体干细胞移植到DMD患者体内,使其分化成肌细胞并表达肌萎缩蛋白,从而治疗患者。

 

DMD的研究中仍有许多问题等待我们去揭示。我们需要结合各种动物模型,在各个层面对DMD从病因到治疗进行深入研究,最终实现治愈DMD的目的[4-5]

 

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杜氏肌营养不良机理研究

 

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*声明:RDDC数据和工具仅为科研使用,仅供参考,不可作为医学诊断和评判的最终定论。

 

参考文献及引用图片来源:

[1]王雪丁,陶玉倩,苏启表,黄民.基因编辑在杜氏肌营养不良症中的研究现状[J].中国临床药理学杂志,2020,36(04):475-477+480.DOI:10.13699/j.cnki.1001-6821.2020.04.025.

[2]张紫玲,陆茜,徐登球,俞沁玮,江振洲.杜氏肌营养不良小鼠肌损伤对肝脏脂质代谢的影响及其作用机制[J].中国药科大学学报,2021,52(06):735-741.

[3]李统宇,梁平.杜氏肌营养不良疾病模型及基因治疗研究进展[J].浙江大学学报(医学版),2016,45(06):648-654.

[4]纪伟,田国力,王燕敏.杜氏肌营养不良症基因治疗新进展[J].药学与临床研究,2021,29(03):207-210.DOI:10.13664/j.cnki.pcr.2021.03.012.

[5]杨一娴,李昌盛,王蓓蕾,党素英.杜氏肌营养不良症治疗研究进展[J].中国医药导报,2019,16(31):56-59.

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