腺相关病毒包装

腺相关病毒包装

赛业生物采用第2代重组腺相关病毒包装系统制备病毒颗粒。该包装系统包含3个质粒和一株包装细胞株。

1)1个转移质粒:含有两侧有AAVITR序列的转基因表达盒子。

2)1个Rep-cap表达质粒:表达Rep和Cap两个基因。

3)1个辅助质粒:包含来自腺病毒的一些基因(E4、E2a和VA)。这些腺病毒的基因可以促进AAV基因组的复制。

4)1株含有腺病毒E1基因的293细胞。

 

野生型腺相关病毒基因组是一条长约4.7 kb的线性单链DNA(ssDNA)分子。基因组两末端各有一个145 nt长的Inverted Terminal Repeat (ITR),ITR序列是对称的,自己能形成发夹结构。病毒感染细胞后,释放出单链病毒基因组,末端发夹结构促使腺相关病毒以单链基因组为模板复制互补链,形成双链DNA。野生型病毒只表达2个基因:rep (replication) 和cap (capsid),Rep编码非结构蛋白,Cap编码结构蛋白。腺相关病毒基因组不编码polymerase,基因组DNA的复制需要用到宿主细胞表达的polymerase。将基因组上的Rep和Cap基因删除,克隆到质粒上,然后将目的基因克隆在两个ITR之间,这个质粒就成为转移质粒。而Rep和Cap基因被克隆到另外一个质粒上,成为Rep-cap表达质粒。除了Rep-cap表达质粒,还需要一个辅助质粒。这个辅助质粒表达腺病毒的一些基因(E4、E2a和VA),这些腺病毒基因可以促进AAV基因组的复制。除了3个质粒外,腺相关病毒包装系统还需要一株表达腺病毒E1基因的293细胞。

 

每次包装重组腺相关病毒,辅助质粒均固定不变,只要血清型不变,Rep-cap质粒也是相对固定,变化的是编码目的基因的转移质粒。因此您需重点设计转移质粒,点击这里即可轻松快捷地设计!

 

腺相关病毒包装

 

AAV血清型

AAV2是目前使用最广泛的血清型。不同血清型的腺相关病毒对不同组织有不同的感染性。使用不同的rep-cap质粒与转移质粒包装病毒,可获得不同血清型的腺相关病毒颗粒。下表列举了不同血清型的组织感染性。您可以通过基因载体智慧设计平台选择不同血清型的腺相关病毒包装服务

    

   Serotype Tissue Tropism
   AAV1    SM, CNS, lung, retina, pancreas, heart, liver
   AAV2    SM, CNS, liver, kidney, retina
   AAV3    SM
   AAV4    CNS, retina, lung, kidney
   AAV5    SM, CNS, lung, retina
   AAV6    SM, heart, lung, adipose, liver
   AAV7    SM, retina, CNS, liver
   AAV8    SM, CNS, retina, liver, pancreas, heart, kidney, adipose
   AAV9    SM, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, testes, kidney
   AAVrh10    SM, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, kidney

   

腺相关病毒生产

生产携带目的基因的重组腺相关病毒颗粒,过程如下图:

Recombinant Adeno-associated Virus Production

 

首先将转移质粒、Rep-cap质粒和辅助质粒转染到293T细胞。更换新鲜的培养基后,继续培养48小时,然后收集细胞,裂解细胞,进行离心浓缩,即可得到转导细胞级别的病毒颗粒。

 

质量控制

我们对每一批病毒都进行了qPCR滴度检测,严格把控质量,让您百分百放心。

 
服务明细

服务 交付标准 周期 推荐用途
标准规格包装 冷冻病毒(滴度:~1x1011 GC/ml,体积:1ml) 7-14 天 细胞转导
大规格包装 冷冻病毒(滴度:~1x1012 GC/ml,体积:1ml) 7-14 天 细胞转导

 

赛业生物不仅提供基因表达慢病毒定制服务,还提供shRNA干扰腺相关病毒定制服务。订制病毒从订制转移质粒开始,点击这里即可轻松快捷地设计转移质粒!

 

腺相关病毒载体

(一)基因表达腺相关病毒载体

基因表达腺相关病毒载体图谱

 

基因表达腺相关病毒载体由腺相关病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUC ori。腺相关病毒基因组序列是从元件5'ITR开始,到元件3'ITR结束。

腺相关病毒基因组序列可容纳一个外源基因表达盒子,即目的基因表达盒子。目的基因表达盒子包括三部分序列:启动子、目的基因和polyA。polyA已经克隆在载体上,每次构建载体,只需通过site-specific recomination cloning技术将感兴趣的启动子和目的基因序列克隆到载体上即可。

 

1、克隆方法

我们采用位点特异性重组的克隆方法,将感兴趣的启动子和目的基因序列克隆到腺相关病毒载体上。

 

2、质量控制

我们会对每一个pDown上的目的基因片段进行测序验证,序列正确后,再进行重组。之后对基因表达腺相关病毒载体挑克隆,并进行酶切鉴定,酶切鉴定合格后交付。

 

(二)shRNA干扰腺相关病毒载体

shRNA干扰腺相关病毒载体图谱

 

shRNA干扰腺相关病毒载体由腺相关基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUC ori。腺相关病毒基因组序列是从元件5'ITR开始,到元件3'ITR结束。

腺相关病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是shRNA表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性marker供您选择。shRNA表达盒子则包括三部分序列:U6启动子、shRNA和终止子。U6启动子已经克隆在载体上,每次构建载体,只需通过annealing-ligation技术将感兴趣的shRNA和终止子克隆到载体上即可。

 

1、克隆方法

我们采用引物退火连接的克隆方法,将shRNA克隆到腺相关病毒载体上。

 

2、质量控制

我们会对每一个shRNA干扰腺相关病毒载体进行挑克隆,并测序shRNA片段。正确后,再进行酶切鉴定,酶切鉴定合格后交付。

 

服务类别 重组慢病毒 重组腺病毒 重组腺相关病毒
载体原型 HIV-1 5 型腺病毒 AAV2
包装细胞 293T 293A 293T
病毒基因组形式 两条线性的、连续的单链RNA 一条线性的、连续的双链DNA 一条线性的、连续的单链DNA
病毒基因组大小 野生型病毒:约9.2 kb 野生型病毒:约36 kb 野生型病毒:约4.7 kb
病毒颗粒直径 80~130 nm 70~90 nm 18~26 nm
包膜 有。重组慢病毒包膜上有VSVG蛋白 没有 没有
目的细胞类型 分裂和非分裂的哺乳动物细胞 分裂和非分裂的哺乳动物细胞 分裂和非分裂的哺乳动物细胞
病毒基因组是否整合到宿主基因组 随机整合 游离 游离
病毒滴度 108 ~109 TU/ml 1010 ~1012 PFU/ml 1011~1012 GC/ml
免疫原性 非常低
可插入外源DNA片段大小 最高可达6.4 kb 最高可达8.3 kb 最高可达4.7 kb
外源基因表达时间 整合到细胞基因组,长时间稳定表达 游离于细胞基因组,短暂表达 可形成episome,长时间表达
优点

  1、  应用范围广;

  2、  转导效率高;

  3、  稳定遗传。

  1、  转导效率高;

  2、  可携带大片段目的基因;

  3、  病毒可扩增。

  1、  安全性高;

  2、  免疫原性低。