载体构建

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基因载体智慧设计平台

赛业生物旗下的基因载体智慧设计平台是一款功能强大的在线载体设计工具,每年可定制载体超10万个。您只需轻轻点击鼠标,在网站享受拼接载体乐趣的同时,随时保存、上传即可快速完成专属于您的载体设计。依托高效快捷的基因载体智慧设计平台平台,我们可以同时将数以千计的目的基因在1-2周内构建到各自的表达载体中。

 

我们为您提供慢病毒载体、CRISPR慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及其它常规载体构建服务。

 

一、慢病毒载体

1、基因表达慢病毒载体

慢病毒载体

 

基因表达慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。慢病毒基因组序列是从元件5’LTR开始,到3’LTR结束。


慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是目的基因表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性双marker供您选择。目的基因表达盒子则包括两部分序列:启动子和目的基因。每次构建载体,只需通过site-specific recombination cloning技术将感兴趣的启动子和目的基因克隆到载体上即可。

 

1)克隆方法

我们采用位点特异性重组的克隆方法,将感兴趣的启动子和目的基因克隆到慢病毒骨架上。如下图:

克隆方法

一般来说,我们将启动子放在pUp入门克隆上,将目的基因放在pDown入门克隆上。由于我们已建成了一套常用启动子的pUp,因此每次构建时,我们只需构建一个携带目的基因的pDown,再与您选择的启动子和慢病毒骨架载体进行位点特异重组反应则可获得基因表达慢病毒载体。

 

2)质量控制

我们会对每一个pDown进行目的基因片段测序,序列正确后再进行重组,然后对基因表达慢病毒载体挑克隆,并进行酶切鉴定。酶切鉴定合格后交付。

 

2、shRNA干扰慢病毒载体

干扰慢病毒载体

 

shRNA干扰慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。慢病毒基因组序列是从元件5’LTR开始,到3’LTR结束。


慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是目的基因表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性双marker供您选择。shRNA表达盒子则包括三部分序列:U6启动子、shRNA和终止子。U6启动子已经克隆在载体上,每次构建载体,只需通过annealing-ligation技术将感兴趣的shRNA和终止子克隆到载体上即可。

 

1) 克隆方法

我们采用引物退火连接的克隆方法,将shRNA克隆到慢病毒骨架上。如下图:

shRNA克隆

我们的shRNA干扰慢病毒载体使用了human U6 promoter转录shRNA。shRNA在体内被剪切成21 nt的单链RNA,并与mRNA互补引起mRNA的降解。而干扰效率则取决于21 nt的单链RNA是否只与目标mRNA特异性100%匹配。您可以登陆基因载体智慧设计平台选择感兴趣的人、小鼠和大鼠的shRNA进行载体设计。

 

2)质量控制

我们会对每一个shRNA干扰慢病毒载体进行挑克隆,并测序shRNA片段。正确后,再进行酶切鉴定,酶切鉴定合格后交付。

 

3、gRNA慢病毒载体

gRNA慢病毒载体

 

gRNA慢病毒载体由慢病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。慢病毒基因组序列是从元件5’LTR开始,到3’LTR结束。


慢病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是目的基因表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性双marker供您选择。gRNA表达盒子则包括三部分序列:U6启动子、gRNA和终止子。U6启动子已经克隆在载体上,每次构建载体,只需通过annealing-ligation技术将感兴趣的gRNA打靶序列克隆到载体上即可。gRNA打靶序列与gRNA scaffold序列构成一个完整的gRNA。

 

1)克隆方法

我们采用引物退火连接的克隆方法,将gRNA克隆到慢病毒骨架上。

我们的CRISPR/Cas9慢病毒载体使用了human U6 promoter转录gRNA。gRNA被Cas9识别,与基因组序列结合,从而引起Cas9对基因组序列的剪切。剪切效率取决于gRNA 是否只与目标基因组序列特异性100%匹配。目标序列的选择还需要考虑下游有PAM特征的序列。您可以登陆基因载体智慧设计平台选择感兴趣的人、小鼠和大鼠的9RNA进行载体设计。

 

二、腺病毒载体

1、基因表达腺病毒载体

腺病毒载体

 

基因表达腺病毒载体由腺病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。腺病毒基因组序列是从元件5’ITR开始,到元件3’ITR结束。

腺病毒基因组序列可容纳一个外源基因表达盒子,即目的基因表达盒子。目的基因表达盒子包括三部分序列:CMV启动子、目的基因和polyA。CMV启动子和polyA已经克隆在载体上,每次构建载体,只需通过site-specificrecominationcloning技术将感兴趣的目的基因序列克隆到载体上即可。

 

1)克隆方法

我们采用位点特异性重组的克隆方法,将目的基因克隆到腺病毒骨架上。如下图:

特异性重组的克隆方法

 

一般来说,将目的基因放在pDown入门克隆上。每次构建,我们只需构建一个携带目的基因的pDown,再与携带了CMV启动子的腺病毒骨架载体进行位点特异重组反应就可获得基因表达腺病毒载体。

 

2)质量控制

我们会对每一个pDown进行目的基因片段测序,序列正确后再进行重组。然后对基因表达慢病毒载体挑克隆,并进行酶切鉴定。酶切鉴定合格后交付。

 

2、shRNA干扰腺病毒载体

shRNA干扰腺病毒载体

 

shRNA干扰腺病毒载体由腺病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUC ori。腺病毒基因组序列是从元件5’ITR开始,到元件3’ITR结束。

腺病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是shRNA表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了EGFP和mCherry两种荧光marker供您选择。shRNA表达盒子则包括三部分序列:U6启动子、shRNA和终止子。U6启动子和Marker基因表达盒子已经克隆在pDown入门克隆上,每次构建载体,只需通过annealing-ligation技术将感兴趣的shRNA和终止子克隆到pDown载体上,再通过site-specific recomination cloning技术将pDown入门克隆克隆到载体上即可。

 

1)克隆方法

我们采用引物退火连接和位点特异重组的克隆方法,将shRNA克隆到腺病毒载体上。

我们的shRNA干扰慢病毒载体使用了human U6 promoter转录shRNA。shRNA再体内被剪切成21nt的单链siRNA,21nt的单链siRNA与mRNA互补引起mRNA的降解。干扰效率决定于21nt的单链siRNA是否只与目标mRNA特异性100%匹配。您可以通过基因载体智慧设计平台选择感兴趣的人、小鼠和大鼠的shRNA进行载体设计。

 
2)质量控制

我们会对每一个shRNA干扰腺病毒载体进行挑克隆,并测序shRNA片段。正确后,再进行酶切鉴定,酶切鉴定合格后交付。

 

三、腺相关病毒载体

1、基因表达腺相关病毒载体

基因表达腺相关病毒载体

 

基因表达腺相关病毒载体由腺相关病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUC ori。腺相关病毒基因组序列是从元件5'ITR开始,到元件3'ITR结束。

腺相关病毒基因组序列可容纳一个外源基因表达盒子,即目的基因表达盒子。目的基因表达盒子包括三部分序列:启动子、目的基因和polyA。polyA已经克隆在载体上,每次构建载体,只需通过site-specific recomination cloning技术将感兴趣的启动子和目的基因序列克隆到载体上即可。

 

1)克隆方法

我们采用位点特异性重组的克隆方法,将感兴趣的启动子和目的基因序列克隆到腺相关病毒载体上。

 

2)质量控制

我们会对每一个pDown上的目的基因片段进行测序验证,序列正确后,再进行重组。之后对基因表达腺相关病毒载体挑克隆,并进行酶切鉴定,酶切鉴定合格后交付。

 

2、shRNA干扰腺相关病毒载体

干扰腺相关病毒载体

 

shRNA干扰腺相关病毒载体由腺相关基因组序列和细菌质粒序列构成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUC ori。腺相关病毒基因组序列是从元件5'ITR开始,到元件3'ITR结束。

腺相关病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是shRNA表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性marker供您选择。shRNA表达盒子则包括三部分序列:U6启动子、shRNA和终止子。U6启动子已经克隆在载体上,每次构建载体,只需通过annealing-ligation技术将感兴趣的shRNA和终止子克隆到载体上即可。

 

1)克隆方法

我们采用引物退火连接的克隆方法,将shRNA克隆到腺相关病毒载体上。

 

2)质量控制

我们会对每一个shRNA干扰腺相关病毒载体进行挑克隆,并测序shRNA片段。正确后,再进行酶切鉴定,酶切鉴定合格后交付。

 

四、其它载体

1、常规质粒载体

常规质粒载体是基于pUC载体改造而成,由真核序列和细菌质粒序列组成。细菌骨架部分仅含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUC ori,这比很多商品载体的细菌骨架都要小,因此能容纳更多的外源DNA序列。

真核序列部分可容纳两个外源基因表达盒子:一个是目的基因表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性双marker供您选择。目的基因表达盒子则包括三部分序列:启动子、目的基因和polyA。PolyA已经克隆在骨架上。每次构建载体,只需要通过site-specific recomination cloning技术将感兴趣的启动子和目的基因克隆到载体上即可。

常规质粒载体可以用来转染细胞,也可以用来注射动物。

常规质粒载体

 

2、PiggyBac载体

PiggyBac载体是由PiggyBac转座子序列和细菌质粒序列组成。细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。PiggyBac转座子序列是从元件5‘ITR开始,到元件3’ITR结束。

PiggyBac转座子序列可容纳两个外源基因表达盒子:一个是目的基因表达盒子,另外一个是marker基因表达盒子。Marker基因表达盒子已经克隆在载体上,无需重新构建。我们提供了荧光marker、抗药性marker或者荧光/抗药性双marker供您选择。目的基因表达盒子则包括三部分序列:启动子、目的基因和polyA。PolyA已经克隆在骨架上,每次构建载体,只需通过site-specific recomination cloning技术将感兴趣的启动子和目的基因克隆到载体上即可。

基因克隆载体

 

3、LacZ报告基因载体

LacZ报告基因载体由真核序列和细菌质粒序列组成,细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。

真核序列只由一个外源基因表达盒子组成。该表达盒子包括四部分序列:增强子、Hsp68启动子、LacZ报告基因和polyA。、Hsp68启动子、LacZ报告基因和polyA已经克隆在骨架上,每次构建,只需通过site-specific recomination cloning技术将感兴趣的增强子克隆到载体上即可。

该LacZ报告基因载体常通过显微注射技术制备转基因胚胎或者转基因动物来筛选有功能的增强子序列。

显微注射技术

 

4、pET重组蛋白表达载体

Pet重组蛋白表达载体由蛋白表达功能序列和细菌质粒序列组成,细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个低拷贝复制子pBR322ori。

蛋白表达功能序列由两个外源基因表达盒子组成:一个是Lacl基因表达盒子,另外一个是目的基因表达盒子。目的基因表达盒子包括五部分序列:T7启动子、LacO序列、RBS、目的基因和T7终止子。T7启动子、LacO序列、RBS和T7终止子已经克隆在骨架上,每次构建载体,只需通过酶切连接技术将感兴趣的目的基因克隆到载体上即可。

pET重组蛋白表达载体用于蛋白表达,相比pBAD载体,pET的蛋白表达量更高。

pET重组蛋白表达载体

 

5、pBAD重组蛋白表达载体

pBAD重组蛋白表达载体由蛋白表达功能序列细菌质粒序列组成,细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。

蛋白表达功能序列由两个外源基因表达盒子组成:一个是araC基因表达盒子,另外一个是目的基因表达盒子。目的基因表达盒子包括四部分序列:araBAC启动子、RBS、目的基因和rrnB终止子已经克隆在骨架上,每次构建载体,只需通过酶切连接技术将感兴趣的目的基因克隆到载体上即可。

pBAD重组蛋白表达载体用于蛋白表达,相比pET载体,pBAD的表达更严谨。

pET载体

 

五、Cyagen 多基因表达系统

Cyagen 不仅提供单个基因表达载体构建服务,而且提供多基因表达载体构建服务。多基因表达的概念是指在一个启动子的驱动下两个(bicistronic )或者两个以上(multicistronic )的基因同时表达。多基因表达往往需要借助Linker 来帮助实现。Cyagen 的Linker 基因包括两种:Internal Ribosome Entry Site (IRES) 、2A 肽链(2A Peptide)。

 

六、Cyagen 诱导型表达载体系统(inducible expression)

Cyagen 不仅提供组成型表达(constitutive expression )载体构建服务,而且提供诱导型(inducible expression) 表达载体构建服务。诱导型表达是指在诱导型启动子的驱动下,例如TRE,需要rtTA 这样的转录激活因子和doxycycline 药物的存在下,才能表达下游的基因。

 

技术参数

其他元件
用途 抗药性基因 功能描述
正向筛选 Neomycin 真核表达新霉素抗性基因
Puromycin 真核表达嘌呤霉素抗性基因
Hygromycin 真核表达潮霉素抗性基因
Blasticidin 真核表达杀死稻瘟素抗性基因
负向筛选 codA 作为条件致死显性基因,其产物胞嘧啶脱氢酶能将5-氟胞嘧啶(5-fc)转变成有毒的5-氟尿嘧啶(5fu),将阻碍胸苷酸的合成,最终影响DNA的合成。
deltaTK 可使无毒性的丙氧鸟苷(GANC)转变为毒性核苷酸而杀死细胞,可用GANC筛选排除随机整合的细胞株。
用途 调控基因 功能描述
可诱导 rtTA(M2) 通过添加四环素或者强力霉素来调控rtTA的产生,从而控制目的基因的表达。
用途 蛋白标记物 功能描述
标记基因

Flag-tag

His-tag

Myc-tay

融合了标签蛋白的目的蛋白,可通过检测标签蛋白来间接确认目的基因是否正常表达,用于细胞染色、免疫印迹、ELISA和免疫沉淀试验中的蛋白标记。