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大的目的基因可能很难克隆。您可能需要考虑利用BAC重组技术构建BAC调控元件控制的长序列基因。

是的，BAC DNA和质粒DNA显微注射的价格是一样的。过去我们是分别定价的。但是由于BAC DNA注射需求的不断增加，所以我们决定收取与质粒DNA注射相同的低价格来吸引更多的客户。然而我们的经验和文献都显示利用BAC DNA产生转基因小鼠胚胎的成功率比质粒DNA低。因此许多客户对每个BAC DNA会选择进行第二轮注射（即增加注射200个受精卵）。

文献和我们以往的经验告诉我们，产生转基因的成功几率与DNA的质量有很大关系。因此我们为客户提供用于制备BAC DNA或质粒DNA的推荐实验方法。确保DNA已经正确纯化和DNA浓度的精确测定是客户的责任。浓度误差小于2倍就可以显著地影响首代转基因小鼠的产 生。凝胶图片可作为DNA正确纯化和浓度精确测定的证明。

线性化的和环状的BAC DNA我们都接受。传统操作中研究人员常将用于注射的BAC DNA线性化。然而越来越多的实验室不再对BAC DNA进行线性化，他们发现与对应的线性化BAC DNA相比，环状的DNA也可以在转基因胚胎中获得相同的LacZ染色模式。我们的研究也发现确实这样，环状BAC DNA更易于注射且可能产生更好的结果（更高频率的转基因胚胎）。因此我们推荐您考虑注射环状BAC DNA，这样也可以为您节省制备DNA的时间。

用质粒DNA产生首代转基因小鼠的成功率大约是3-4%（也就是对于每次200个受精卵注射，大约可以获得5-8个PCR阳性首代小鼠）。我们允诺至少提供两个经PCR鉴定为阳性的首代转基因小鼠。 我们保证至少两个携带部分或全部转基因的首代小鼠，但是我们不保证转基因的表达或具有生殖系遗传。如果这个转基因是胚胎致死的或客户提供的DNA不能达到要求，客户需要理解他/她要承担显微注射所花费的全部费用。由于BAC的成功率更低，所以不能保证有首代转基因小鼠，然而客户可以根据我们的折扣选择增加一轮注射以提高成功的机会。

根据我们服务的不同的实验室的经验，质粒的成功率是大约3-4%的PCR阳性胚胎（因此，对于每轮200个注射的受精卵，可以获得5-8个PCR阳性的胚 胎）。在PCR阳性的胚胎中，LacZ染色阳性胚胎的百分比在不同的重组子变化显著，这可能反映了重组子本身的生物学特性。对于一些重组子，绝大部分 PCR阳性胚胎也是LacZ阳性的，尽管染色强度和染色模式的次要细节常常改变。对于其它一些重组子，即使我们产生了一打或两打PCR阳性的胚胎，仍然没 有确定的LacZ阳性胚胎。这对我们来说是合理的，因为它意味着PCR阳性胚胎是否具有LacZ阳性依赖于重组子的生物学特性。 BAC的成功率要低得多，大约只有1-2%的PCR阳性胚胎（因此，对于每注射的200个受精卵，大约可以获得2-3个PCR阳性的胚胎）。同样，不同重组子LacZ阳性胚胎的比率也不同。对于一些重组子，绝大部分PCR阳性的胚胎也是LacZ阳性的，对于其它重组子，在所有的PCR阳性胚胎中没有一个 LacZ阳性胚胎。在不同胚胎个体之间，BAC DNA的染色模式比质粒DNA的具有更好的一致性。这是合理的，因为与质粒DNA相比，BAC DNA的表达不那么依赖整合位点，我们研究了从其它核心机构和提供类似服务的商业公司的数据发现我们的成功率虽不比他们高但也实力相当。我们正在不断地提 高我们的操作以获得更好的成功率。

可以。定制固定/染色过程是完全可以的。尽管首选的流程是让我们进行染色，但是也有一些客户需要我们运送固定好但没有染色的胚胎。

我们采用Millipore公司的试剂盒和实验方法进行LacZ染色。到目前为止，我们的客户对我们的染色很满意。对于大龄的胚胎，在染色前我们常常依照客户的要求将胚胎切割成几部分。

我们已经做过的最早时间点是E10.5，最晚时间点是E18.5。对于较晚时期的胚胎，我们依照客户的说明分离出特定的器官或将胚胎切割成几块，以便使内部结构获得更好的染色。但是我们认为我们可以最早做到E8.5，最晚到分娩。