CAR分子设计
CAR分子全称为嵌合抗原受体,其结构包括信号肽分子,抗体来源的单链可变区、铰链区、跨膜区,共刺激分子结构域、CD3ζ信号转导域。
图1 CAR分子结构示意图
分类
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来源 | 功能 | 表达部位 |
信号肽分子
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CD8α、GM-CSF等 |
引导CAR分子上膜 |
胞外 |
抗体scFv |
专利、文献、抗体开发
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靶向识别肿瘤抗原 |
胞外 |
铰链区 |
CD8α、IgG1、IgG4、IgGD等 |
维持scFv同细胞膜间的相对空间构象
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胞外 |
跨膜区 |
CD8α、CD28、CD4等 |
锚定CAR分子膜表达 |
跨膜 |
共刺激分子 |
4-1BB、CD28、CD27、ICOS等 |
提供T细胞活化第二信号 |
胞内 |
信号转导分子 |
CD3ζ |
提供T细胞活化第一信号 |
胞内 |
表1 CAR分子设计中常用原件
载体构建
在设计好CAR分子后,通常需要对其进行基因合成并亚克隆至慢病毒穿梭质粒上,构建后的其结构通常如图所示。此外,赛业生物还可以提供多种现货型的CAR慢病毒质粒载体库,靶点包括人的CD19、BCMA、GPC3、FAP和HER2等,且该载体库还在不断的丰富和更新中。
图2 CAR慢病毒载体结构图示
病毒包装和纯化
赛业生物在慢病毒制备方面具有多年的经验,可以提供多样化的慢病毒制备服务。赛业使用安全性高的第三代慢病毒包装系统,其制备流程如图所示。
图3 慢病毒包装技术路线
服务项目
交付物:载体构建报告、慢病毒质检报告、慢病毒浓缩液
客户提供资料:靶点抗原信息、抗体scFv序列(可选)、CAR分子结构信息、所需载体信息
服务优势
服务案例
将表达CD19抗原的慢病毒纯化液进行梯度稀释(0.01、0.1、1、10μL四个梯度),分别加入到相同数量的293T细胞中,72小时后流式检测293T细胞阳性率(即被慢病毒感染的293T细胞占细胞总数的百分比),进而计算慢病毒的转导滴度。如图所示,CD19抗原阳性细胞的数量随转染病毒梯度的增加而逐渐升高,表明该慢病毒有良好的感染活性,并计算病毒滴度为:1.4×108 TU/mL。
图4 CD19抗原慢病毒滴度检测结果
使用上述CD19抗原慢病毒转染293T细胞,经过多轮筛选,得到CD19抗原高度均一表达的CD19-293T稳转细胞。
图5 CD19-293T细胞CD19抗原阳性率检测结果
我们设计了如下结构的靶向CD19抗原的FMC63 CAR分子,并将其构建慢病毒载体上,进行慢病毒制备。采用上述方法检测FMC63 CAR慢病毒滴度,病毒滴度约为:4.33×108 TU/mL。
图6 FMC63 CAR分子结构
图7 FMC63 CAR慢病毒滴度检测结果