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CAR分子设计和慢病毒制备

CAR分子设计

CAR分子全称为嵌合抗原受体,其结构包括信号肽分子,抗体来源的单链可变区、铰链区、跨膜区,共刺激分子结构域、CD3ζ信号转导域。

  • scFv筛选:scFv亲和力和特异性对CAR分子功能有重要影响,筛选合适的scFv十分重要
  • 连接基团(Linker)的优化:设计不同长度的Linker,使VH和VL之间的灵活度增加,进而影响结合亲和力
  • 铰链区(Hinge)的优化:设计不同长度的Hinge,增加抗原结合域的空间灵活度
  • 共刺激结构域的选择:可选择不同的共刺激分子(如4-1BB或CD28等)
  • 报告基因:可连接绿色荧光蛋白基因,表征CAR分子是否转导成功

 

图1 CAR分子结构示意图

 

分类
来源 功能 表达部位
信号肽分子

CD8α、GM-CSF等

引导CAR分子上膜

胞外

抗体scFv

专利、文献、抗体开发

靶向识别肿瘤抗原

胞外

铰链区

CD8α、IgG1、IgG4、IgGD等

维持scFv同细胞膜间的相对空间构象

胞外

跨膜区

CD8α、CD28、CD4等

锚定CAR分子膜表达

跨膜

共刺激分子

4-1BB、CD28、CD27、ICOS等

提供T细胞活化第二信号

胞内

信号转导分子

CD3ζ

提供T细胞活化第一信号

胞内

表1 CAR分子设计中常用原件

 

载体构建

在设计好CAR分子后,通常需要对其进行基因合成并亚克隆至慢病毒穿梭质粒上,构建后的其结构通常如图所示。此外,赛业生物还可以提供多种现货型的CAR慢病毒质粒载体库,靶点包括人的CD19、BCMA、GPC3、FAP和HER2等,且该载体库还在不断的丰富和更新中。

图2 CAR慢病毒载体结构图示

 

病毒包装和纯化

         赛业生物在慢病毒制备方面具有多年的经验,可以提供多样化的慢病毒制备服务。赛业使用安全性高的第三代慢病毒包装系统,其制备流程如图所示。

图3 慢病毒包装技术路线

 

服务项目

  • CAR分子设计及载体构建
  • CAR慢病毒制备
  • 靶抗原稳转细胞株构建

交付物:载体构建报告、慢病毒质检报告、慢病毒浓缩液

客户提供资料:靶点抗原信息、抗体scFv序列(可选)、CAR分子结构信息、所需载体信息

 

服务优势

  • 丰富的CAR分子设计经验,可提供专业的各种定制化的CAR分子设计服务
  • 丰富的CAR慢病毒质粒载体库,可提供快速优质的服务
  • 抗原高表达、高稳定性的稳转细胞株构建服务
  • 高滴度高纯度的慢病毒制备
  • 严格的质控标准

 

服务案例

  • CD19抗原慢病毒滴度检测

将表达CD19抗原的慢病毒纯化液进行梯度稀释(0.01、0.1、1、10μL四个梯度),分别加入到相同数量的293T细胞中,72小时后流式检测293T细胞阳性率(即被慢病毒感染的293T细胞占细胞总数的百分比),进而计算慢病毒的转导滴度。如图所示,CD19抗原阳性细胞的数量随转染病毒梯度的增加而逐渐升高,表明该慢病毒有良好的感染活性,并计算病毒滴度为:1.4×108 TU/mL。

图4 CD19抗原慢病毒滴度检测结果

 

  • CD19-293T稳转细胞株构建

使用上述CD19抗原慢病毒转染293T细胞,经过多轮筛选,得到CD19抗原高度均一表达的CD19-293T稳转细胞。

图5 CD19-293T细胞CD19抗原阳性率检测结果

 

  • FMC63 CAR慢病毒滴度检测

我们设计了如下结构的靶向CD19抗原的FMC63 CAR分子,并将其构建慢病毒载体上,进行慢病毒制备。采用上述方法检测FMC63 CAR慢病毒滴度,病毒滴度约为:4.33×108 TU/mL。

 

图6 FMC63 CAR分子结构

 


图7 FMC63 CAR慢病毒滴度检测结果

 

 

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