基因敲除载体

CRISPR/Cas9简介

CRISPR/Cas9系统是近几年出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA。此tracrRNA/crRNA二元复合体引导Cas9蛋白与crRNA配对的序列靶位点处剪切双链DNA，产生一个平末端的双链DNA缺口（Double Strand Breaks，DSB）。通过基因工程手段将crRNA/tracrRNA进行融合改造成一条sgRNA（Single Guide RNA），也能有效引导Cas9蛋白在靶点处进行切割。

图1 CRISPR/Cas9切割DNA示意图

使用CRISPR/Cas9进行基因敲除的技术原理

在哺乳动物细胞内，大部分DSB会通过非同源的末端连（NonHomologous End-Joining，NHEJ）途径或者同源重组修复（Homology-Directed Repair，HDR）途径进行修复。通常情况下的NHEJ 修复途径占优势，且容易导致缺口处产生插入或缺失突变（Indels）。

当使用一条sgRNA在蛋白编码基因的外显子内产生DSB时，若NHEJ修复导致了缺口处产生了非3倍数的indels，则会造成蛋白翻译时的读码框移码（Framshift），不再产生完整的蛋白，即“移码敲除”。

当使用两条sgRNA同时作用造成两个DSB时，NHEJ修复不但可造成染色体DNA片段的缺失，同时也可能造成读码框移码。这种基因组的双重修饰更强有力地破坏了编码蛋白的表达，即“片段敲除”。

图2 使用CRISPR/Cas9进行基因敲除示意图

使用CRISPR/Cas9进行点突变/基因敲入的技术原理

在外源供体DNA存在的情况下，供体DNA有几率通过同源重组的方式与切口处附近的基因组DNA进行碱基片段交换，因此HDR修复途径能进行精确的基因修饰。供体DNA作为修复模板，包含一段目的序列，其两侧序列与切口附近的基因组序列一致作为同源臂。这种供体DNA可以是单链的DNA（ssDNA），也可以是双链的DNA（dsDNA）。对于小的序列修改（如点突变），可以选择合成ssDNA Oligo作为修复模板。当需要进行大片段的序列修改时（如敲入荧光蛋白标签），则需要将目的序列与数百碱基长度的同源臂克隆至供体质粒，使用供体质粒作为修复模板。

HDR通常只活跃在分裂细胞中，受细胞状态和基因位点影响，其效率较NHEJ更低。

赛业生物提供的服务

为满足不同实验需求，赛业生物可根据您的需要量身定制您专属的CRISPR/Cas9载体。只需要您提供靶基因名称、种属、NCBI GeneID等信息，我们就可以为您设计CRISPR/Cas9载体。如果您需要靶向指定的转录本或者特殊的DNA区域，我们亦可以帮您实现目标。

我们可以提供下表所示的载体类型与基因元件来构建您的CRISPR/Cas9表达载体

载体案例展示（双gRNA慢病毒表达载体）

服务优势 

√ 赛业生物在基因编辑领域有丰富的经验积累，每年构建基因敲除载体超万条，经验丰富的团队可以帮助您快速完成基因修饰载体的设计与构建。

√ 赛业生物不仅可提供单gRNA载体构建，更可提供双gRNA载体构建服务。双gRNA载体可实现片段敲除，敲除高效彻底，并有多种荧光和抗性可供选择，可满足客户多元化的应用需求。

√ 所有CRISPR/Cas9载体都经过测序与酶切双重鉴定，以确保产品质量。

服务流程

服务周期

客户提供

客户只需要提供Gene ID或基因名以及种属信息即可。

载体使用流程

图3 使用CRISPR/Cas9载体进行基因敲除的流程

常见问题分析

问题：质粒载体的转染率低？

对策：优化转染方法，或者使用高效的转基因方法（例如慢病毒），并且可以通过使用抗生素杀死阴性细胞或流式细胞术分选荧光细胞以提高阳性细胞比例。

问题：细胞的单克隆形成率低？

对策：某些细胞单克隆化后难以增殖和形成细胞群落。提高血清浓度、使用正常培养的细胞培养上清、令单克隆与正常培养的细胞进行间接共培养，有助于提高克隆形成率。

问题：筛选出了很多单克隆杂合子，但无法筛选出纯合子？

对策：通常是敲除的靶基因对细胞的生存和增殖有巨大影响，是细胞不可或缺的基因。

问题：基因敲除的单克隆纯合子依然能检测到蛋白表达？

对策：通常是抗体的特异性不够好，能与其他蛋白反应形成假阳性。可以更换不同的抗体进行实验，另外必要时重新鉴定单克隆细胞的基因型。