CRISPR-Pro基因敲除/敲入大鼠

基因敲除大鼠

 

与小鼠相比,大鼠体型较大,其生理学特征易于研究,是多种人类疾病的重要模式动物。

 

大鼠是研究生理学的理想模型,研究者已经得到了大量的纯系大鼠,并且在大鼠的行为、细胞、生理、生化、药理和毒理学方面积累了大量的数据;大鼠还是研究人类高血压、糖尿病、乳腺癌和神经系统疾病的理想动物模型。大鼠在形成乳腺癌等肿瘤时的激素反应和人非常相似。从某种程度上说,大鼠是目前最适合的人类疾病动物模型之一,是可以将基因组和功能结合起来的动物模型。

 

大鼠同时也是药理学研究的首选动物,并且被广泛应用于心血管疾病、运动疾病的研究领域。大鼠可以用来模拟几乎所有已知的人类疾病,了解大鼠的遗传结构将帮助研究人员发现与疾病相关的基因,从而更加清楚地认识基因以及环境对人类的健康造成的影响。大鼠一直广泛应用于药物的效力以及安全性测试工作,对大鼠基因组序列的了解,将为药物干涉提供新的目标,这将对新药的研制产生巨大的推动作用。

 

赛业基因敲除大鼠服务的优势
  
针对超排大鼠胚胎受精比例低而畸形胚胎比例高,卵细胞品系和个体间差异大,核膜和质膜更厚更有弹性导致更难注射等难点,赛业生物的研发人员不断优化生产过程各个环节,并在促排卵和受精卵注射两个环节获得突破性进展,大幅度提高了生产效率。此外,赛业生物大鼠基因敲除技术不仅可以敲除SD大鼠的基因,还可以实现Long evans大鼠、F344 大鼠、Wistar大鼠和Brown Norway大鼠的基因敲除。

  

赛业目前大鼠项目可选的品系及其特点如下:

 

1SD大鼠:产仔多、生殖力强 、生长发育快、抗病能力强。自发肿瘤率低,对性激素感受性高。常用作营养学、内分泌学和毒理学等方面的研究。

2Wistar大鼠:性周期稳定,繁殖力强,生长发育快。性情温顺,抗病性强,自发肿瘤率低。广泛用于营养学、生理学、药理学、毒理学及病理生理学等的研究。

3F344(CDF)大鼠:旋转运动性差,血清胰岛素含量低,脑垂体大。可允许多种肿瘤移植生长,癌症发生的研究中应用较多。

4Long evans大鼠:广泛用于行为学、营养学、神经学、毒理学和眼科方面的研究。不易感染呼吸道疾病,对于需要延长吸入麻醉时间的外科手术有非常大的优势。

5Brown Norway大鼠:野生Norway大鼠的变种,毛呈褐色,最早用于遗传学研究。对实验性过敏性脑脊髓炎及自身免疫性复合型肾小球肾炎有抗性。

    

   

CRISPR-Pro技术原理

Cas9/gRNA复合物在靶位点进行切割,产生双链断裂(DSBDouble-strand break),迫使细胞进行紧急修复。通常条件下,细胞偏向于使用非同源末端连接(NHEJnonhomologous DNA end joining)的方式对断裂的双链进行修复,进而造成靶位点基因的插入/缺失突变。CRISPR-Pro技术采用独特的受精卵处理方式让受精卵偏好同源重组修复路径,大大提高同源重组效率,使得DNA大片段敲入(KI)及条件性敲除cKO)得以实现。

CRISPR

 

CRISPR-Pro技术优势

1)周期短,效率高;

2)高嵌合率,生殖遗传稳定;

3)可实现DNA大片段敲入(长达10Kb);

4)可实现条件性敲除(长达4kb);

5)可实现大片段敲除(长达20kb)。

 

Jackson Lab CRISPR/Cas9基因编辑效率 VS Cyagen CRISPR-Pro基因编辑效率

项目类型 基因敲除效率对比
CRISPR/Cas9(Jackson Lab) CRISPR-Pro(Cyagen)
基因移码敲除 高效 高效
基因片段敲除 高效 高效
点突变/小标签基因敲入 一般 高效
cDNA片段基因敲入(≤4kb 效率较低 高效,可长达10kb
条件性基因敲除 效率较低 高效,可长达4kb

***与Jackson Lab展示的CRISPR/Cas9基因编辑效率相比,赛业生物(CyagenCRISPR-Pro在敲入片段长度与敲入效率方面都更具优势。

 

CRISPR-Pro服务流程与周期

 

CRISPR-Pro基因敲除常用大鼠模型

完全性基因敲除大鼠

CRISPR-Pro完全性基因敲除大鼠是通过CRISPR /Cas9基因敲除技术,针对靶基因设计和构建gRNACas9表达质粒,造成目的基因的功能区域被敲除,获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的大鼠模型。

CRISPR-Pro完全性基因敲除包括:移码突变、片段基因敲除、双/多基因敲除。

 

移码突变鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因设计、构建相应的gRNA质粒,体外转录为RNA后,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子大鼠;

2、F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配,获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子大鼠;

3、选择来自同一只F0代大鼠,基因型一致的F1代大鼠,达到性成熟后进行互配,可获得F2代大鼠。对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代大鼠中25%为纯合子,50%为杂合子,25%为野生大鼠。

 CRISPR基因敲入

 

片段基因敲除鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因不同位点设计、构建相应的一对gRNA质粒,体外转录为RNA后,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子大鼠;

2F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配,获得PCR鉴定阳性的F1代杂合子大鼠;

3、选择来自同一只F0代大鼠,基因型一致的F1代大鼠,达到性成熟后互配,可获得F2代大鼠。对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代大鼠中25%为纯合子,50%为杂合子,25%为野生大鼠。

 

双(多)基因敲除鼠的建系原则与流程

1、通过针对两个靶基因分别设计、构建相应的gRNA质粒,体外转录为RNA后,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代多基因杂合子大鼠;

2F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配,获得PCR和测序鉴定阳性的F1代双基因杂合子大鼠;

3、选择双基因杂合子大鼠进行杂交,获得F2代大鼠。对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定。

 

条件性基因敲除大鼠

条件性基因敲除是通过把两个LoxP位点插入到目的基因的一个或几个重要外显子的两端以制备出有两个floxed大鼠。该floxed大鼠在与表达Cre重组酶大鼠杂交之前,该基因表达正常;当floxed大鼠与组织特异性表达Cre酶的大鼠进行杂交后,可实现在特定的组织或细胞中敲除该基因,而在其它组织或细胞中该基因表达正常。

 

建系原则与流程:

1、与野生型大鼠杂交:阳性CRISPR-Pro大鼠(+/flox)与野生型大鼠(+/+)杂交,获得F1代杂合子大鼠(+/flox);

2、挑选一对F1代杂合子大鼠(+/flox)进行自交,获得F2代纯合子大鼠(flox/flox)。

CRISPR基因敲除小鼠

 

基因敲入大鼠

CRISPR-Pro基因敲入大鼠是利用CRISPR/Cas9基因敲入技术,针对靶基因设计、构建相应的 gRNA质粒和donor vector,通过Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重组,引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型)或将报告基因(如EGFP,mRFP,mCherry,mYFP,或LacZ等)引入目的基因的特定位点,从而可以通过报告基因来跟踪目标基因的表达;也可以用报告基因取代大小鼠本身的基因,使KO/KI同时发生。

   

CRISPR-Pro基因敲入大鼠包括:点突变、片段基因敲入。

 

点突变鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因设计、构建gRNA质粒并转录为RNA,再合成含有突变位点信息的donor oligo,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子大鼠;

2F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配,获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子大鼠;

3  选择来自同一只F0代大鼠,敲入位点一致的F1代大鼠,达到性成熟后进行同胞交配,可获得F2代大鼠。对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代大鼠中25%为敲入位点一致的纯合子大鼠,有50%为只有一条染色体敲入的杂合子大鼠,有25%为野生型大鼠。

 

片段基因敲入的建系原则与流程

1、通过针对靶基因设计、构建gRNA质粒和含有突变位点信息的donor vector,将以上质粒转录为mRNA后,与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子大鼠;

2F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配,获得PCR鉴定基因型和测序鉴定随机插入的F1代杂合子大鼠;

3  选择来自同一只F0代大鼠,敲入位点一致的F1代大鼠,达到性成熟后进行同胞交配,可获得F2代大鼠。对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定,理论上,F2代大鼠中25%为敲入位点一致的纯合子大鼠,有50%为只有一条染色体敲入的杂合子大鼠,有25%为野生型大鼠。

 

Rosa26定点基因敲入大鼠

指在Rosa26位点插入某种基因的基因敲入大鼠模型(也称转基因大鼠模型)。Rosa26位点基因敲入大鼠模型不仅插入位点精准,同时由于Rosa26是安全区域,所以外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达;而且由于是单拷贝基因插入,因此更容易预测表达量;结合Cre-loxP系统,可使外源基因在特定组织及特定时间稳定表达,可用来高效构建多用途的条件性基因敲入大鼠模型,因此越来越受到科研人员的青睐。

 

构建原理图:

Rosa26位点基因敲入(基于CRISPR-Pro技术)

Rosa26位点基因敲入

 

Rosa26位点条件性基因敲入(基于CRISPR-Pro技术)

Rosa26位点条件性基因敲入

 

构建流程:

Rosa26定点基因敲入小鼠构建流程

 

技术优势:

1. 外源基因的重组位置确定,更有利于表达;

2. 结合Cre-loxP系统,可以使外源基因在特定组织及特定时间表达;

 

H11位点基因敲入大鼠

Rosa26是一个经典的基因插入位点,虽然对于Rosa26位点的研究较多,但制作多基因插入小鼠时仍需要其他合适的插入位点。H11(Hipp11)是另一个可供选择的插入位点,也是一个安全区域,在此位点的插入基因不会影响其他基因表达,同时此插入基因的表达也不会受到周边区域的影响。

H11位于大鼠 11 号染色体,是位于Eif4enif1与Drg1两个基因之间的一个位点,于 2010 年由 Hippenmeyer S.发现,整合到 H11 位点的外源基因可以稳定高效的表达。利用Crispr/Cas9基因编辑技术,可将外源的基因片段定点插入到大鼠的H11位点。与Rosa26相比,其优点是不受旁侧启动子影响,因此更合适用于表达外源基因。结合loxp系统,可构建组织特异性表达大鼠模型。

 

构建原理图:

H11位点基因敲入小鼠构建原理图

 

构建流程:

H11位点基因敲入小鼠构建流程

 

技术优势:

1. 稳定性高,后代表达一致;

2. 实用性强,能实现A基因在Rosa26位点及B基因在H11位点同时过表达;

3. 经济实惠,F1代即可开始实验。