诱导多能干细胞（iPSC）能再分化成特定的细胞类型、组织和器官，联合基因编辑技术使用，可用于探索疾病发生的机制、开发新型有效的药物和细胞治疗等。赛业生物iPSC体外疾病模型研究平台，拥有成熟的基因编辑技术和干细胞培养体系，攻克了iPS细胞培养难、基因编辑、单克隆化难等多方面问题，同时结合一站式表型分析服务，可为客户打造多种疾病应用场景的体外模型构建和检测服务。欢迎拨打400-680-8038或邮件至info@cyagen.com或点击侧边栏在线咨询联系我们。
iPSC体外疾病模型研究思路
使用iPSC体外疾病模型的优势
小鼠模型不能完全展现人类疾病的表型与发生机制，使用基因编辑iPSC细胞疾病模型更能模拟人类疾病的发生。
可创造遗传背景单一的细胞系，减少因遗传背景差异而导致的表型变异。
iPSC在体外可无限扩增和定向分化，有利于大规模的药物筛选和替代较难获得的原代细胞系。
iPSC体外疾病模型服务内容及交付标准
| 类型 | 项目 | 交付标准 | QC | 周期 | 订购 |
|---|---|---|---|---|---|
| CRISPR基因编辑细胞系（iPSC） | 基因敲除（KO） | 1个单克隆纯合子细胞株 2管（10*6/管），实验报告 | PCR和测序，免疫荧光 | 8-12周 | |
| 定点突变（PM） | 1个单克隆纯合子细胞株 2管（10*6/管），实验报告 | PCR和测序，免疫荧光 | 12-18周 | ||
| 基因敲入（KI） | 1个单克隆杂合子细胞株 2管（10*6/管），实验报告 | PCR和测序，免疫荧光 | 12-18周 | ||
| 稳转细胞株（iPSC） | 敲低表达稳转株 | 稳转细胞株 2管/株（10*6/管），包含对照细胞株，实验报告 | qPCR，免疫荧光 |
Cell pool 9-11周 单克隆 13-15周 |
|
| 过表达稳转株 | 稳转细胞株 2管/株（10*6/管），包含对照细胞株，实验报告 | qPCR，免疫荧光 |
Cell pool 8-10周+基因合成 单克隆 12-14周+基因合成 |
*额外检测服务根据客户需求：可提供核型、脱靶、流式、WB、luciferase、增殖、凋亡、周期、迁移/侵袭等。
构建iPSC体外疾病模型的技术难点与赛业生物的解决方案
| 难点 | 赛业生物解决方案 |
|---|---|
| 细胞培养：培养条件苛刻，编辑过程容易分化，失去干性 | 16年干细胞培养经验，拥有成熟的iPSC编辑和培养体系。通过赛业生物的培养体系，我们可培养出理想的iPS集落：内部紧实、大小均匀且边缘清晰。 |
| iPSC基因编辑：不同个体和组织来源的iPSC差异较大，基因操作难度高 |
成熟稳定的基因编辑平台，拥有上万例基因编辑项目经验，iPSC项目成功经验丰富 1. 智能的Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统：可科学设计高效率、低脱靶的gRNA。 2. 自研的α-donor载体HDR系统：HDR效率高达50%，远高于市面上的编辑效率，可实现无痕修复（footprint-free）。 3. 合适的转染条件：通过优化转染条件，转染效率>50%，活率高达80%。 4. RNP递送体系：选择RNP递送提升gRNA切割效率和转染细胞活率，降低脱靶效率，KO效率高达90%。 |
| 单克隆形成：单克隆化制备复杂，克隆形成率较低 | 具备独特的单细胞筛选技术，单克隆形成率可达30%以上，通过筛选一轮即可获得足够的阳性克隆。 |
智能KO方案设计系统马上体验
Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统
赛业iPSC基因编辑的技术优势
成熟基因编辑技术平台
从体内动物实验到体外细胞实验，上万例成功基因编辑项目积累。
从体内动物实验到体外细胞实验，上万例成功基因编辑项目积累。
优化升级的iPSC基因编辑体系
新升级递送载体HDR效率高达50%，转染效率>50%，转染活率>80%。
新升级递送载体HDR效率高达50%，转染效率>50%，转染活率>80%。
独创Smart-CRISPR™技术
全新升级的细胞基因编辑系统Smart-CRISPR™，轻松实现基因敲除、基因敲入除等多种策略，编辑效率高达90%。
全新升级的细胞基因编辑系统Smart-CRISPR™，轻松实现基因敲除、基因敲入除等多种策略，编辑效率高达90%。
快速交付
稳转株周期快至8周，基因敲除周期快至8周，敲入周期快至12周。
稳转株周期快至8周，基因敲除周期快至8周，敲入周期快至12周。
专业的项目管理
24h内出方案，定期反馈项目进展，博士团队技术支持，详尽的交付报告，并可根据要求提供不同克隆（纯合子、杂合子和对照）细胞的交付。
24h内出方案，定期反馈项目进展，博士团队技术支持，详尽的交付报告，并可根据要求提供不同克隆（纯合子、杂合子和对照）细胞的交付。
iPSC体外疾病模型服务案例
① iPSC-EGFP-KI细胞模型建立
② iPSC-hTNFAIP8L2-KO细胞模型建立
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在诱导性多能干细胞iPSC中的某基因中插入EGFP荧光标记（700bp）。如下图所示，在外显子E2的上下游设计sgRNA，并设计包含EGFP的Donor序列。通过RNP法将sgRNA和Donor转染到iPSC中，经过HDR途径将EGFP序列插入外显子E2序列的后段。
图1 EGFP敲入方案设计
经过PCR和测序鉴定，确定获得在外显子E2序列后插入EGFP的杂合iPSC细胞系。细胞培养后经G显带进行染色体核型分析，显示染色体数为46数目正常，染色体结构无明显异常。通过免疫荧光染色，检测NANOG、OCT4和SOX2三个干性标记基因，均能检测出阳性信号，表明该敲入细胞具有干性。
Marker
WT:2430bp; KI:3213bp
注：引物设计策略为扩增整个EGFP及其所在基因组上下游的部分序列。无插入EGFP的带型为2430bp，成功插入EGFP的带型应在3213bp处出现条带。结果显示，编号1到8等8个单克隆在2430bp和3213bp处出现条带，说明这些克隆已经成功插入EGFP，且为杂合克隆。
图2 iPS-EGFP KI琼脂糖凝胶电泳鉴定结果
KI条带 5’ sequence：
AGGCAGAAACAGAAAAGAATGAAATATTCCGCCGGCAT--TGGAAGCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCA
KI条带 3’ sequence：
CGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA--AAGACTCTTGGCCTCTCCAGAGACGCCCCTTTCCTCGTCC
注：KI条带 5’ sequence展示序列为EGFP插入片段的5’端及其所在基因组的上游部分序列；KI条带 3’ sequence为EGFP插入片段的3’端及其所在基因组的下游部分序列。测序分析KI条带5’序列和3’序列均可与EGFP匹配且为套峰，证明克隆为EGFP插入片段的杂合子克隆。
图3 iPS-EGFP KI测序结果
图4 iPS-EGFP KI核型分析（细胞培养后经G显带进行染色体核型分析，显示染色体数为46数目正常，染色体结构无明显异常）
图5 iPS-EGFP免疫荧光-干性检测（通过免疫荧光染色，检测NANOG、OCT4和SOX2三个干性标记基因，均能检测出阳性信号，表明该敲入细胞具有干性）
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在诱导性多能干细胞iPSC中敲除Human TNFAIP8L2基因。通过小片段的敲除方法，在TNFAIP8L2的2号外显子设置两条sgRNA，预计删除2号外显子300bp。经过PCR和测序鉴定，确定获得TNFAIP8L2基因敲除的纯合IPS细胞。再通过免疫荧光染色，检测NANOG、OCT4和SOX2三个干性标记基因，均能检测出阳性信号，表明该敲除细胞具有干性。
图1 hTNFAIP8L2的敲除策略
图2 iPSC-hTNFAIP8L2-KO测序检测
图3 iPSC-hTNFAIP8L2-KO干性检测
iPSC体外疾病模型应用场景
帕金森病机制研究
干细胞治疗心梗
过继细胞免疫治疗
阿尔茨海默病药物筛选
帕金森病机制研究：PARK2-KO-iPSC模型的构建
帕金森病（PD）是一种不可治愈的神经退行性疾病，其特征是中脑多巴胺能神经元的进行性丧失和随后的纹状体多巴胺耗竭。散发性和家族性PD发病机制多因为线粒体功能障碍和氧化应激。其中，PARK2基因的突变（对线粒体功能有重要影响）会导致常染色体隐性家族性帕金森病。
帕金森病发病机制中帕金森功能障碍的研究，所用到的帕金森基因敲除动物模型仅表现出轻微的疾病表型。而来自家族性PD患者的诱导多能干细胞（iPSCs）或通过基因组编辑引入的具有PARK2突变的细胞，能够在体外研究人类多巴胺能神经元的帕金功能障碍。具有PARK2突变的PD患者iPSC衍生神经元显示氧化应激增加、α-突触核蛋白积累以及线粒体形态和功能紊乱。
作者在WT-iPSC的基础上对PARK2进行敲除，获得PARK2-KO-iPSC。再将WT-iPSC和PARK2-KO-iPSC分化成多巴胺能神经元。对两种iPSC进行蛋白质组变化的通路分析，发现PARK2
KO神经元细胞周期调节、氧化应激和能量代谢的紊乱。并且通过多种实验检测发现PARK2-KO神经元的线粒体和形态产生异常、糖酵解和乳酸代谢不足、细胞增殖和存活率降低。
参考文献：Bogetofte H, Jensen P, Ryding M, et al. PARK2 Mutation Causes Metabolic Disturbances and
Impaired Survival of Human iPSC-Derived
Neurons. Front Cell Neurosci. 2019;13:297. Published 2019 Jul 5. doi:10.3389/fncel.2019.00297
干细胞治疗心梗：过表达CCND2可增强hiPSC衍生的心肌细胞的增殖能力
近几十年来临床终末期充血性心力衰竭（CHF）的治疗有了显著的改善，但成功率仍然受到心肌细胞再生能力的限制。进行性心力衰竭的分子和细胞基础是受损和凋亡的心肌细胞无法被替换的。促进心肌再生的策略包括将常驻心脏成纤维细胞体内重编程为心肌细胞样细胞，移植体干/祖细胞衍生的心肌细胞（CMs），以及旨在招募内源性祖细胞或促进内源性CMs中细胞周期活性和增殖的治疗。
作者前期已经证明过表达CCND2可增强hiPSC衍生的心肌细胞的增殖能力。然后作者将WT-CCND2或OE-CCND2的人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为心肌细胞（分别为CCND2WTCMs或CCND2OECM），并注入梗死猪心。通过评价心肌功能、心肌细胞增殖、病变区血管生成和心肌细胞耐氧能力，发现对比野生型CCND2的人心肌细胞，过表达CCND2的人心肌细胞具有更强的增殖能力、心脏修复能力，并且心脏的病原性扩大变小，死肌组织减小，心脏功能得到改善，具有很好的治疗效果。
参考文献：Zhao M, Nakada Y, Wei Y, et al. Cyclin D2 Overexpression Enhances the Efficacy of Human Induced
Pluripotent Stem Cell-Derived
Cardiomyocytes for Myocardial Repair in a Swine Model of Myocardial Infarction. Circulation.
2021;144(3):210-228.
doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.120.049497
过继细胞免疫治疗：iPSCs可以在体外无限培养并成功分化为淋巴样谱系，诱导成功率高
过继细胞免疫治疗包括了CAR-T、TCR-T、NK疗法等。这些疗法都具有广阔的应用前景和治疗作用，但是应该过程中也面临者一些挑战。而iPSC联合基因编辑在一定程度可解决这些困境。
CAR-T疗法的治疗原理是在T细胞中表面上表达可以匹配肿瘤细胞表面抗原的CAR分子，并以此特异性杀伤肿瘤细胞。CAR-T疗法一般是用患者的T细胞进行编辑改造，这里面临着一些难题，比如患者T细胞的扩增和功能受限，难以满足治疗的需求；T细胞难以被编辑；制备CAR-T细胞耗时，耽误患者治疗。NK疗法的原理与CAR-T疗法的治疗原理相似，也是通过分离自体或者异体免疫效应细胞,经过体外激活并回输到到患者体内,直接杀伤肿瘤,或者激发机体抗肿瘤免疫反应。但NK面临着增殖能力有限、不容易被基因编辑。
iPSC联合基因编辑可以解决这些问题。iPSCs可以很容易地在体外进行遗传转化。结合基因编辑技术，对HLA和TCR等于免疫相关的基因进行编辑，开发通用型CAR-T细胞，可有效降低免疫原性、增加其适用性、效力和持久性。iPSCs可以在体外无限培养并成功分化为淋巴样谱系，解决原代细胞数量有限、不好扩增等问题。IPS细胞诱导为NK细胞的成功率高，且功能表型成熟。
参考文献：Nianias A, Themeli M. Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)-Derived Lymphocytes for Adoptive
Cell Immunotherapy: Recent Advances
and Challenges. Curr Hematol Malig Rep. 2019;14(4):261-268. doi:10.1007/s11899-019-00528-6
阿尔茨海默病药物筛选：建立Aβ42-OE-iPSC，可用于筛选Aβ42的抑制剂药物
阿尔茨海默病（Alzheimer's
disease，AD）是发生于老年和老年前期、以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变。目前认为β淀粉样蛋白（Aβ42）在大脑中大量产生是导致疾病发生的原因。因此可以建立Aβ42-OE-iPSC，用于筛选Aβ42的抑制剂药物。利用基因编辑等技术，构建Aβ42-OE-iPSC，再分化成神经元细胞，即可用高通量筛选有效的Aβ42的抑制剂药物。
