诱导多能干细胞(iPSC)能再分化成特定的细胞类型、组织和器官,联合基因编辑技术使用,可用于探索疾病发生的机制、开发新型有效的药物和细胞治疗等。赛业生物iPSC体外疾病模型研究平台,拥有成熟的基因编辑技术和干细胞培养体系,攻克了iPS细胞培养难、基因编辑、单克隆化难等多方面问题,同时结合一站式表型分析服务,可为客户打造多种疾病应用场景的体外模型构建和检测服务。欢迎拨打400-680-8038或邮件至info@cyagen.com或点击侧边栏在线咨询联系我们。
类型 | 项目 | 交付标准 | QC | 周期 | 订购 |
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CRISPR基因编辑细胞系(iPSC) | 基因敲除(KO) | 1个单克隆纯合子细胞株 2管(10*6/管),实验报告 | PCR和测序,免疫荧光 | 8-12周 | |
定点突变(PM) | 1个单克隆纯合子细胞株 2管(10*6/管),实验报告 | PCR和测序,免疫荧光 | 12-18周 | ||
基因敲入(KI) | 1个单克隆杂合子细胞株 2管(10*6/管),实验报告 | PCR和测序,免疫荧光 | 12-18周 | ||
稳转细胞株(iPSC) | 敲低表达稳转株 | 稳转细胞株 2管/株(10*6/管),包含对照细胞株,实验报告 | qPCR,免疫荧光 |
Cell pool 9-11周 单克隆 13-15周 |
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过表达稳转株 | 稳转细胞株 2管/株(10*6/管),包含对照细胞株,实验报告 | qPCR,免疫荧光 |
Cell pool 8-10周+基因合成 单克隆 12-14周+基因合成 |
*额外检测服务根据客户需求:可提供核型、脱靶、流式、WB、luciferase、增殖、凋亡、周期、迁移/侵袭等。
难点 | 赛业生物解决方案 |
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细胞培养:培养条件苛刻,编辑过程容易分化,失去干性 | 16年干细胞培养经验,拥有成熟的iPSC编辑和培养体系。通过赛业生物的培养体系,我们可培养出理想的iPS集落:内部紧实、大小均匀且边缘清晰。 |
iPSC基因编辑:不同个体和组织来源的iPSC差异较大,基因操作难度高 |
成熟稳定的基因编辑平台,拥有上万例基因编辑项目经验,iPSC项目成功经验丰富 1. 智能的Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统:可科学设计高效率、低脱靶的gRNA。 2. 自研的α-donor载体HDR系统:HDR效率高达50%,远高于市面上的编辑效率,可实现无痕修复(footprint-free)。 3. 合适的转染条件:通过优化转染条件,转染效率>50%,活率高达80%。 4. RNP递送体系:选择RNP递送提升gRNA切割效率和转染细胞活率,降低脱靶效率,KO效率高达90%。 |
单克隆形成:单克隆化制备复杂,克隆形成率较低 | 具备独特的单细胞筛选技术,单克隆形成率可达30%以上,通过筛选一轮即可获得足够的阳性克隆。 |
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,在诱导性多能干细胞iPSC中的某基因中插入EGFP荧光标记(700bp)。如下图所示,在外显子E2的上下游设计sgRNA,并设计包含EGFP的Donor序列。通过RNP法将sgRNA和Donor转染到iPSC中,经过HDR途径将EGFP序列插入外显子E2序列的后段。
经过PCR和测序鉴定,确定获得在外显子E2序列后插入EGFP的杂合iPSC细胞系。细胞培养后经G显带进行染色体核型分析,显示染色体数为46数目正常,染色体结构无明显异常。通过免疫荧光染色,检测NANOG、OCT4和SOX2三个干性标记基因,均能检测出阳性信号,表明该敲入细胞具有干性。
注:引物设计策略为扩增整个EGFP及其所在基因组上下游的部分序列。无插入EGFP的带型为2430bp,成功插入EGFP的带型应在3213bp处出现条带。结果显示,编号1到8等8个单克隆在2430bp和3213bp处出现条带,说明这些克隆已经成功插入EGFP,且为杂合克隆。
注:KI条带 5’ sequence展示序列为EGFP插入片段的5’端及其所在基因组的上游部分序列;KI条带 3’ sequence为EGFP插入片段的3’端及其所在基因组的下游部分序列。测序分析KI条带5’序列和3’序列均可与EGFP匹配且为套峰,证明克隆为EGFP插入片段的杂合子克隆。
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,在诱导性多能干细胞iPSC中敲除Human TNFAIP8L2基因。通过小片段的敲除方法,在TNFAIP8L2的2号外显子设置两条sgRNA,预计删除2号外显子300bp。经过PCR和测序鉴定,确定获得TNFAIP8L2基因敲除的纯合IPS细胞。再通过免疫荧光染色,检测NANOG、OCT4和SOX2三个干性标记基因,均能检测出阳性信号,表明该敲除细胞具有干性。