干细胞诱导前的状态和干细胞诱导前的纯度对诱导的成功与否至关重要。若干细胞诱导前的状态很差，则诱导不一定成功；若干细胞诱导前纯度不高，则诱导的阳性率会很低，甚至为零。

一般建议重新诱导，选择代次较早，状态较好，纯度较高的细胞诱导，诱导时间可相对延长或诱导周期从A液诱导3天B液维持1天改成A液诱导4天B液维持1天。

（１）赛业提供的成软骨诱导液是无血清培养体系，需要在15mL的锥形底离心管中进行诱导；

（２）细胞密度：诱导终浓度为2.5×10⁵/500µl；

（３）细胞加入诱导液之后24h之内不要摇动离心管，首次弹起细胞的时间一般是24-48h；之后每两天进行一次换液，每次换液之前需要将细胞团弹起以便与诱导液充分接触；

（４）细胞团直径增至2mm左右时终止诱导，进行后续的石蜡切片以及阿利新蓝染色鉴定。

冻存好的干细胞是通过干冰运输的；收到细胞株包裹时，请检查干冰、细胞株冷冻管是否有融化、解冻情形，若有请在收到细胞后填写完整《产品信息质量反馈表》描述好细胞质量问题（尽量进行拍照取证）后，尽快与我们（020-28069038）联系。若无异常，请立即开始复苏细胞，或立即置于液氮冷冻保存。

一般在使用我们配套培养基、并且完全按照我们的说明书进行操作的情况下，复苏没有问题的。但是如果由于客户的操作原因导致细胞复苏不成功，我们承诺可以优惠的价格再提供一株。

（1）准备 37°C 水浴和预热到 37°C的完全培养液；准备好一个15mL的离心管，同时加入9mL的完全培养液；

（2）准备好这些后，将细胞从液氮中取出，放入到水浴锅中，同时轻轻摇动，保证细胞能够在2min内完全溶解，同时应该注意不要把冻存管的管口没入水浴中（可能由水引起污染）；

（3）溶解完全的细胞要快速转移到无菌超净台中，用75％酒精棉球擦外表面。用吸管将冻存管中细胞悬液吸到15mL的含有培养液的离心管中，同时用培养液洗2次冻存管，一起加到离心管中吹匀，避免产生泡沫；

（4）250 g 离心 5 min；弃上清液，加入2-3mL预热的完全培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全重悬；

（5）将重悬的细胞接种到T25或者是T75的培养瓶中，加入适量的培养液，再把细胞摇均匀，放入37°C 、5% CO2 培养箱中；

（6）第二天进行换液，保证去除死细胞。正常的培养过程是三天进行一次换液，如果细胞长到有80-90％汇合进行传代。

冻存：将冻存管放入冻存盒里，再放入-80℃过夜，由于聚氯乙烯导热比较慢，所以温度可慢慢降下来，次日可直接放入液氮罐。

（１）水浴锅温度：严格控制在37℃，且解冻时冻存管管口切勿浸没到水中；

（２）解冻时间：2min以内，解冻时在水浴锅中快速晃动冻存管，管中残留一点固体时即可将其拿至超净台；

（３）复苏接种密度：一管细胞（1×10⁶个） 接种到1个T25（底面积25cm²）中，摇匀后置于37℃、5%CO2的培养箱中培养；

（４）复苏时候的细胞相对脆弱，整个过程需尽量避免吹打时气泡的产生，重悬细胞时动作需轻柔以免损伤细胞导致复苏后生长状态不佳。

（1）胰酶浓度：推荐胰酶使用浓度为0.25%-0.04%EDTA，使用之前需预热至37℃且pH值应维持在7.2左右。切忌消化过度（包括胰酶浓度过高、消化时间过长等），否则会导致细胞死亡、分化、状态变差，分化能力丢失等现象。细胞消化过程中需要在显微镜下观察细胞的消化程度，当看到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱落，此时应立即终止消化，若细胞仍有大部分贴壁，可适当延长消化时间以避免消化不彻底的情况出现。

（2）细胞的差异：不同种类的干细胞差异很大，特别是与肿瘤细胞株的差异更大，很多经验不可以直接使用，消化时需要仔细摸索最佳的时间。

（3）接种密度：干细胞传代过程中接种密度至关重要，如果太低会导致细胞增殖缓慢，甚至导致细胞老化，而细胞的老化是不可逆转的。一般细胞接种密度为20000个活细胞/cm2即50 0000个活细胞/T25，不同的干细胞接种密度会稍有差异，比如hMSC，我们推荐的传代接种比例为1:2。

细胞汇合度达到80%时需给细胞传代，密度过大时细胞增殖会出现接触抑制从而导致细胞老化或者消化过程出现成团的现象。

细胞冻存密度：1×10⁶个活细胞/mL，冻存密度太大或者太小均会影响细胞的复苏效果；

冻存条件：置于-80℃冰箱过夜，次日移到液氮中保存细胞。细胞加入冻存液放入-80℃冰箱后的1小时内需保证冰箱门处于关闭状态，以避免温度的波动导致冻存效果不佳。

只需提供您所感兴趣的基因名称、相关文献和要求即可。