Cell Research 发文称NgAgo有效 但韩春雨的实验仍不可重复

日期: 2016年11月15日


    

Cell Research 发文称NgAgo有效 但韩春雨的实验仍不可重复

 

11月11日晚上8点左右,Cell Research杂志以Letter to Editor形式在线发表了来自南通大学和复旦大学研究人员合作完成(该文通讯作者刘东博士和作者之一复旦大学王永明研究员)题为“NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”的论文(下图),该文结果表明 gDNA/NgAgo 系统在斑马鱼中能实现特定基因敲低导致鱼眼部发育缺陷,但是不能对靶基因进行基因编辑。

 

gDNA/NgAgo 系统

 

这篇文章中作者的研究的靶基因名为Fabp11a(Fatty acid binding protein 11a,脂肪酸结合蛋白11a),该基因在参与调解葡萄糖和脂代谢稳态方面具有重要作用,但是在斑马鱼胚胎发育中该基因的功能未知。对此,作者想知道NgAgo系统是否能在斑马鱼中工作,针对Fabp11a基因设计了两条5'-磷酸化的ssDNA(下图1),与优化过的NgAgo-2nls mRNA一起注射到1细胞期的胚胎中,有趣的是他们观察到注射过的胚胎中最终约有30%会产生严重的眼部发育表型。第一类表型:眼部有一只相对小一点的眼睛而另一只显得十分小;第二类表型:两只眼睛融合形成一只较大的眼睛(见下图2)。

 

Fabp11a基因设计

图1

NgAgo-2nls mRNA

图2

 

为了证明是否斑马鱼出现的表型是由于Fabp11a基因遗传突变造成的,作者抽提了正常斑马鱼胚胎和突变斑马鱼胚胎的DNA对靶基因进行PCR扩增,结果测序结果表明靶基因没有发生任何基因突变,但是通过RT-PCR检测Fabp11a基因的表达惊奇的发现该基因的表达有显着敲低(见下图E)。

 

RT-PCR检测

 

为了更清楚的说明问题,作者进一步做了一些实排除了单独由NgAgo-2nls mRNA或者gDNA注射到胚胎导致的表型,而且同时注射NgAgo-2nls mRNA和错配的gDNA也不会产生表型,这些实验结果表明gDNA/NgAgo系统有其特异性。另外实验结果表明gDNA/NgAgo系统靶向敲低Fabp11a基因导致的斑马鱼眼部的表型可以通过注射Fabp11a mRNA回复表型(见上图D)。

 

为了进一步确认gDNA/NgAgo系统在斑马鱼中敲低基因是一种普遍的现象,作者又test的另外一个基因ta(no tail/ntl or brachyury),结果表明也有大约30%注射过的胚胎出现没有尾巴的表型(见下图)。

 

gDNA/NgAgo系统

 

此前韩春雨NBT文章中表明gDNA/NgAgo系统在人源细胞(37℃)中能够有效的产生11.2%-41.3% 的indels。Cell Res这篇文章中也在37℃的条件下检测了斑马鱼中gDNA/NgAgo系统是否能产生indels,结果表明没有检测到任何indels发生。有趣的是在正常情况下,斑马鱼胚胎中注射gDNA和酶活突变的NgAgo mRNA也能产生系列表型,当然同样检测不到任何indels的发生。为了再进一步确认斑马鱼的表型是由于Fabp11a敲低造成的,作者还做了一些后续的原位杂交实验,而且还运用CRISPR/Cas9技术敲除Fabp11a基因也能得到相似的表型,当然基因敲除的表型显然异常剧烈一些,有约10%的胚胎出现眼睛消失的表型。

 

总的来说,这项研究结果通过使用gDNA/NgAgo系统在斑马鱼中实现了特定基因的敲低,但是没有检测到靶基因上任何indels的出现,因为酶活突变的NgAgo也能产生敲低的效果,作者猜测这个系统可能和酶活突变的Cas9:sgRNA系统类似都能在靶基因处抑制基因转录。

 

基因敲低(knockdown)和基因敲除(knockout)的区别

 

简单说来,我们的生命活动基本由蛋白质作为机器来完成(RNA 的功能也正在越来越多地被发掘),根据中心法则“DNA-RNA-蛋白质”最简化的套路,如果想抑制某个蛋白的功能,可以从 DNA、RNA、蛋白质三个层面进行调控。在DNA或者基因组水平的调控是最彻底的,基因组编辑(genome editing)即对基因组上的目的基因进行删除、突变、或插入,历史上沿用至今的常用工具包括ZFN(锌指蛋白酶)、TALEN 和 CRISPR。在RNA层面的编辑最常用的是RNA干扰,通过抑制RNA的转录或者促进RNA的降解从而降低RNA水平,影响其翻译成蛋白质以及相关性状的发生,被称为“敲低”(knockdown)。

 

抑制RNA

 

knockdown(敲低)与knockout(敲除)是完全不同的两个概念。基因敲低是将基因表达水平下调,而不涉及靶基因 DNA 本身的变化,基本是不可遗传的。基因敲除属于基因(组)编辑技术,必须是在基因组水平上造成突变,破坏基因读码框,消除整个基因的表达。一般来说,在受精卵水平的基因编辑变化能够稳定地遗传给下一代。敲低与敲除二者最明显的区别是基因组DNA序列是否发生变化。

 

备注:原文转自生物谷《国内研究者Cell Research发文韩春雨NgAgo有效,但是敲低未敲除》

         由"赛业生物科技(www.cyagen.com)"整理发布

 

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