Cell Research 发文称NgAgo有效 但韩春雨的实验仍不可重复

Cell Research 发文称NgAgo有效 但韩春雨的实验仍不可重复

11月11日晚上8点左右，Cell Research杂志以Letter to Editor形式在线发表了来自南通大学和复旦大学研究人员合作完成（该文通讯作者刘东博士和作者之一复旦大学王永明研究员）题为“NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish”的论文（下图），该文结果表明 gDNA/NgAgo 系统在斑马鱼中能实现特定基因敲低导致鱼眼部发育缺陷，但是不能对靶基因进行基因编辑。

这篇文章中作者的研究的靶基因名为Fabp11a（Fatty acid binding protein 11a，脂肪酸结合蛋白11a），该基因在参与调解葡萄糖和脂代谢稳态方面具有重要作用，但是在斑马鱼胚胎发育中该基因的功能未知。对此，作者想知道NgAgo系统是否能在斑马鱼中工作，针对Fabp11a基因设计了两条5'-磷酸化的ssDNA（下图1），与优化过的NgAgo-2nls mRNA一起注射到1细胞期的胚胎中，有趣的是他们观察到注射过的胚胎中最终约有30%会产生严重的眼部发育表型。第一类表型：眼部有一只相对小一点的眼睛而另一只显得十分小；第二类表型：两只眼睛融合形成一只较大的眼睛（见下图2）。

图1

图2

为了证明是否斑马鱼出现的表型是由于Fabp11a基因遗传突变造成的，作者抽提了正常斑马鱼胚胎和突变斑马鱼胚胎的DNA对靶基因进行PCR扩增，结果测序结果表明靶基因没有发生任何基因突变，但是通过RT-PCR检测Fabp11a基因的表达惊奇的发现该基因的表达有显着敲低（见下图E）。

为了更清楚的说明问题，作者进一步做了一些实排除了单独由NgAgo-2nls mRNA或者gDNA注射到胚胎导致的表型，而且同时注射NgAgo-2nls mRNA和错配的gDNA也不会产生表型，这些实验结果表明gDNA/NgAgo系统有其特异性。另外实验结果表明gDNA/NgAgo系统靶向敲低Fabp11a基因导致的斑马鱼眼部的表型可以通过注射Fabp11a mRNA回复表型（见上图D）。

为了进一步确认gDNA/NgAgo系统在斑马鱼中敲低基因是一种普遍的现象，作者又test的另外一个基因ta（no tail/ntl or brachyury），结果表明也有大约30%注射过的胚胎出现没有尾巴的表型（见下图）。

此前韩春雨NBT文章中表明gDNA/NgAgo系统在人源细胞（37℃）中能够有效的产生11.2%-41.3% 的indels。Cell Res这篇文章中也在37℃的条件下检测了斑马鱼中gDNA/NgAgo系统是否能产生indels，结果表明没有检测到任何indels发生。有趣的是在正常情况下，斑马鱼胚胎中注射gDNA和酶活突变的NgAgo mRNA也能产生系列表型，当然同样检测不到任何indels的发生。为了再进一步确认斑马鱼的表型是由于Fabp11a敲低造成的，作者还做了一些后续的原位杂交实验，而且还运用CRISPR/Cas9技术敲除Fabp11a基因也能得到相似的表型，当然基因敲除的表型显然异常剧烈一些，有约10%的胚胎出现眼睛消失的表型。

总的来说，这项研究结果通过使用gDNA/NgAgo系统在斑马鱼中实现了特定基因的敲低，但是没有检测到靶基因上任何indels的出现，因为酶活突变的NgAgo也能产生敲低的效果，作者猜测这个系统可能和酶活突变的Cas9：sgRNA系统类似都能在靶基因处抑制基因转录。

基因敲低（knockdown）和基因敲除（knockout）的区别

简单说来，我们的生命活动基本由蛋白质作为机器来完成（RNA 的功能也正在越来越多地被发掘），根据中心法则“DNA-RNA-蛋白质”最简化的套路，如果想抑制某个蛋白的功能，可以从 DNA、RNA、蛋白质三个层面进行调控。在DNA或者基因组水平的调控是最彻底的，基因组编辑（genome editing）即对基因组上的目的基因进行删除、突变、或插入，历史上沿用至今的常用工具包括ZFN（锌指蛋白酶）、TALEN 和 CRISPR。在RNA层面的编辑最常用的是RNA干扰，通过抑制RNA的转录或者促进RNA的降解从而降低RNA水平，影响其翻译成蛋白质以及相关性状的发生，被称为“敲低”（knockdown）。

knockdown（敲低）与knockout（敲除）是完全不同的两个概念。基因敲低是将基因表达水平下调，而不涉及靶基因 DNA 本身的变化，基本是不可遗传的。基因敲除属于基因（组）编辑技术，必须是在基因组水平上造成突变，破坏基因读码框，消除整个基因的表达。一般来说，在受精卵水平的基因编辑变化能够稳定地遗传给下一代。敲低与敲除二者最明显的区别是基因组DNA序列是否发生变化。

备注：原文转自生物谷《国内研究者Cell Research发文韩春雨NgAgo有效，但是敲低未敲除》

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