慢病毒包装问题精选

• 为何我的LV包装出毒量很低？

  为什么都是采用同样的慢病毒包装系统，别人次次成功，我的不是滴度低就是稳定性差？这是因为除了包装系统本身，LV的包装还与下列几个因素密切相关：

  （1）细胞状态：LV的包装一般使用293T细胞，293T细胞的活力、生长状态，是否处于对数生长期、铺板是否均匀等对病毒的产量影响很大，并控制转染前密度为50~60%。

  （2）目的基因：目的基因的大小、序列及翻译的蛋白是否含有毒性均会影响包装效果；例如，若目的片段较大（＞2.5k），则可能会导致包装滴度下降，甚至无法包装。某些过表达会产生细胞毒性的蛋白，可能会导致细胞异常从而出毒量低（可考虑更换为腺病毒）。

  （3）质粒质量：做好阴性对照（GFP组），确保包装目的基因的载体构建的完整性，并做好纯化。

  （4）收毒时机：转染后24、48h观察细胞生长状态及荧光状态，生长状态良好一般于48h第一次收集病毒上清，换液后于72h再次收集病毒上清。

• 包装出来的LV感染细胞效率低？

  理论上LV感染细胞的能力很强，而且能感染分裂和非分裂期的细胞，但为什么我的感染效果总是不理想？影响LV感染效果的因素有哪些？

  （1）细胞类型：有些细胞本身就较难被感染，如某些原代细胞，可考虑加大病毒量或采用浓缩病毒进行感染。

  （2）细胞生长状态：感染细胞前，需要保证细胞处于良好的生长状态，以及合适的生长密度，细胞膜的流动性、与细胞表面的接触面积及表面受体的表达丰富等均会影响病毒感染细胞的效果；另外对于悬浮细胞，可以采用离心感染的方法。

  （3）病毒质量：包装出来的LV应尽量避免冻融，反复冻融会降低病毒的滴度（每次约降低10%），若一次用不完建议分装后储存于-80℃，但即使-80℃也不建议超过6个月；对于4℃保存的LV则尽量3天内用完。

  另外，也可考虑加入Polybrene助感染试剂增强感染效果，但Polybrene本身具有细胞毒性，谨慎使用。

• 为什么我用LV做基因的干扰表达效果不好？

  对于干扰慢病毒，提高病毒量对干扰效果一般不会有改善效果。干扰效果差一般来说是由以下几个原因导致的： 

  （1）shRNA的特异性：shRNA设计而导致的脱靶效应，重新设计shRNA。 

  （2）干扰机制：促进mRNA降解还是抑制翻译？ 

  （3）细胞反馈机制：某些基因表达水平降低会导致核糖体翻译效率上升，表达水平上升。 

  （4）结果判读建议以蛋白为准。

• 怎么确认我的细胞需要多少病毒量才够？那么多规格我该怎么选？

  由于慢病毒的感染谱很广，可以感染分裂期和非分裂期的细胞，对于大部分的细胞类型，采用1×10⁸ TU/ml的规格即可满足要求，另外由于目前慢病毒多用于体外细胞的感染而少用于体内注射，因此非纯化亦可。

  对于难感染的细胞，如原代细胞，需要较高的MOI，需要的病毒量也较多，建议选高规格，如1×10⁹ TU/ml病毒。

  对于较为少见的细胞类型所需要的病毒量，可通过参考文献或预实验确定。