Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统

Di-(2-ethylhexyl) phthalate exposure leads to ferroptosis via the HIF-1α/HO-1 signaling pathway in mouse testes. 点击查看文献解读详情>>

研究思路：
1.体内外验证DEHP刺激可导致睾丸损伤。
2.组学分析与实验验证得出HIF-1α等信号通路出现异常。
3.探索HIF-1α信号通路的作用机制。
4.体外敲除HIF-1α进一步验证HIF-1α的作用。

严谨的研究，需要完整的实验流程，一般采用组学分析科学地筛选基因、得到多种实验结果需要相互印证。基因敲除依旧是基因功能研究的常规策略之一，一个成功的基因敲除细胞株，对验证结果的准确性至关重要。

在这项研究中，作者通过MEHP刺激后的表型分析、RNA-Seq分析、ChIP-qPCR 分析等发现与睾丸细胞功能障碍相关的调控基因：HIF-1α。并初步发现其调控机制：MEHP（体内DEHP的主要生物代谢物）可抑制PHDs，影响HIF-1α积累和稳定，导致HIF-1α易位到细胞核，并诱导Leydig和Sertoli细胞中HIF-1/Hmox1结合，使HO-1的表达上调。HO-1的过表达导致亚铁超载，ROS积累，最终导致铁死亡，损伤Leydig和 Sertoli细胞的活性。

为了进一步确认这一结果，研究人员构建了 HIF-1α基因敲除的Leydig和Sertoli细胞系（HIF-1α基因敲除的Leydig和Sertoli细胞系，由赛业生物提供），用于后续的实验。通过Sanger测序和Western blotting检测，确认了敲除细胞系中的HIF-1α被成功敲除。在与野生型细胞相比，HIF-1α-KO的细胞系在MEHP刺激下细胞活力受损的程度有明显改善。同时，脂质过氧化（图1B，I）和亚铁超载（图1C，J）也受到抑制。分别使用qPCR和Western印迹法评估Hmox1和HO-1水平的表达，发现敲除Hif-1α能逆转MEHP刺激下的Hmox1（图1D，K）和HO-1（图1G，N）表达水平上调。

此外，MEHP刺激后ROS爆发（图1E，L）和细胞死亡（图1F，M）程度也在敲除HIF-1α后减弱。

Western印迹显示敲除HIF-1α恢复了ACSL4、FTH1和SLC7A11的表达，以及抑制GPX4的表达（图1 G，N）。总的来说，这些结果表明，MEHP刺激以HIF-1α依赖的方式导致睾丸Leydig和Sertoli细胞的铁死亡。