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要使某个表型在细胞内稳定表达,可以通过点突变实现,即将外源突变位点通过同源末端重组的方式与基因组中特定位点进行替换。但在实际研发过程中,结果总是不尽人意。在构建细胞株时,你是否难以得到点突变纯合子?培养出来的细胞状态差?相比于基因敲除细胞株,点突变细胞株在设计实验方案时,需要考虑基因片段长短、同源重组效率等多种因素,不同细胞株编辑效率差异很大,构建难度偏高。

经大量测试和实验工艺优化,赛业生物开发了Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统,实现更深度的基因信息分析和更合理的gRNA设计。基于该系统,我们能提供准确快速的点突变细胞株构建服务,通过赛业生物优化的α-donor体系将人源化的Cas蛋白、gRNA和donor三组分转染至目的细胞,产生高效同源重组,实现纯合子交付。现在下单,HEK293T、A549、HCT 116、HEK293等多种细胞的点突变项目均可享受3.98万的优惠价格。

除了体外细胞模型,赛业生物还开发了一系列点突变大小鼠模型,基于成熟的基因编辑平台,可提供从细胞基因表达调控、细胞功能验证、小鼠疾病模型构建及表型分析的全流程服务。欢迎拨打400-680-8038 或邮件至info@cyagen.com 或点击侧边栏在线咨询联系我们。

技术流程
点突变细胞株服务内容
特价细胞
活动时间:
2023年2月23日——3月31日
活动内容:
以下细胞的点突变项目纯合子交付,快至8周,并可享受3.98万的优惠价格。
细胞简称 中文名称 订购
HEK293T 人胚肾细胞
A549 人非小细胞肺癌细胞
HCT 116 人结肠癌细胞
HEK293 人胚肾细胞
Hela 人宫颈癌细胞
BEAS-2B 人正常肺上皮细胞
HK-2 人肾近曲小管细胞
超200种成功案例细胞
类型 典型细胞株 交付标准 QC 周期 订购
肿瘤免疫细胞 THP-1, Jurkat, HepG2, SK-MES-1等 1个单克隆纯合子细胞株2管
(106/管),实验报告
PCR+Sanger测序 快至8周
非癌永生化细胞 HSF, AC16等 1个单克隆纯合子细胞株2管
(106/管),实验报告
PCR+Sanger测序 快至8周
诱导多能干细胞 iPSC 1个单克隆纯合子细胞株2管
(106/管),实验报告
PCR+Sanger测序+免疫荧光 快至8周
干细胞 H1, H9 1个单克隆纯合子细胞株2管
(106/管),实验报告
PCR+Sanger测序+免疫荧光 快至12周
注:除了点突变外,平台还可提供多类型基因编辑细胞株构建服务,如细胞株的基因敲除、敲入以及基因过表达、干扰稳转株等,速来联系我们吧。
“找小鼠,上红鼠”点突变数据库——20万突变位点一键查询
将点突变小鼠建模思路以数据展现,除了提供突变位点详情、建模指导方案,还能便捷查询突变位点相关的参考文献、临床疾病特征等。
AI赋能的罕见病数据中心(RDDC)——全面助力转化医学
突变位点成百上千,如何快速锁定目标?RNA剪接预测、突变致病性预测、小鼠表型预测、ASO预测、SNP可视化等多个基因诊断工具搭配使用,省时又省力。
点突变细胞株技术难点和解决方案
行业技术难点 赛业生物解决方案
gRNA和donor设计不合理,同源重组效率低
智能的Smart-CRISPRTM细胞基因编辑系统:可科学设计高效率、低脱靶的gRNA,编辑效率高达90%;
自研的α-donor系统:HDR效率高达50%,远高于市面上的编辑效率,可实现无痕修复(footprint-free)。
细胞转染方式不当导致效率低
多类型细胞(肿瘤、非肿瘤、干细胞和iPS细胞等)均能在转染前调整至对数生长期状态;
多种转染技术支持,包括磷酸钙共沉淀、人工脂质体法、电穿孔法、病毒感染等。
递送载体选择不当,转染后细胞大量死亡
所用的RNP递送方式使得细胞活率高达90%,悬浮细胞基因编辑效率显著提升。
单克隆生长时间长、制备难以成功
掌握多种独特的制备方法,单克隆形成率可达30%以上,通过筛选一轮即可获得足够的阳性克隆。
单克隆数据杂乱
快至1min分析和鉴定点突变效率及纯合子克隆。
iPS细胞在编辑过程中容易分化,失去干性
17年干细胞项目经验,可培养出理想的iPS集落:内部紧实、大小均匀且边缘清晰。
体外细胞模型存在局限性,与临床结果偏差较大
拥有点突变大小鼠模型,能更好地模拟复杂生物学环境,便于研究疾病机制与药物疗效。
体内体外基因编辑平台优势
成熟的技术平台
从体内动物实验到体外细胞实验,拥有上万例成功基因编辑项目经验、超200种细胞株成功案例和多篇文献引用发表,可提供从细胞基因表达调控、细胞功能验证、小鼠疾病模型构建及表型分析的全流程服务。
独创Smart-CRISPR™技术
拥有全新升级的Smart-CRISPR™细胞基因编辑系统,轻松实现基因敲除、基因敲入等多种策略,编辑效率高达90%。
规模庞大、品种齐全的科研细胞库
我们建设了有各项参数明确、性能稳定的科研细胞库,极大程度规避了基因编辑对细胞的负面影响。
严格的质量控制体系
进行细菌、支原体等微生物的双重检测,确保100%无污染,并充分鉴定基因编辑效果;进行细胞活率检测,保证交付质量。
专业的项目管理
24h内即可出方案,定期反馈项目进展,配备博士团队予以技术支持,提供详尽的交付报告,可根据要求交付不同克隆(纯合子、杂合子和对照)细胞。
点突变细胞株服务案例
01. 自研的α-donor系统在不同细胞中的编辑效率
02. SCARB1(p.K500N, K508N)双位点突变
细胞类型 Cell pool HDR效率 测序峰图 单克隆纯合子阳性率
HEK293人胚肾细胞 13%
高达35%
NCI-H1299人非小细胞肺癌 37%
iPSC诱导多能干细胞 46%
SCARB1是高密度脂蛋白(HDL)的主要受体,促进肝脏从HDL摄取胆固醇。通过CRISPR/Cas基因编辑技术,将肝癌细胞的SCARB1突变成SCARB1(p.K500N, K508N)。如图所示,在点突变附近设计sgRNA和包含点突变的Donor,利用α-donor体系将gRNA和Donor递送到Huh-7细胞中,cell pool检测到的HDR效率为40%,通过制备单克隆获得Huh-7/SCARB1(p.K500N, K508N)双位点突变纯合子克隆。
点突变细胞株应用场景
神经疾病变性机制研究
小分子药物研发

肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种致命的神经退行性疾病,其特点是运动皮层、脑干和脊髓中的运动神经元(MNs)逐渐退化和消失。一些家族性ALS是由超氧化物歧化酶1(SOD1)基因突变引起的。研究人员使用CRISPR/Cas基因组编辑系统和人类诱导多能干细胞(iPSCs),制备了高度纯化的iPSC分化的MNs SOD1-G93A点突变模型。通过与野生型细胞系和患者iPSC(含SOD1-A4V突变)分化的MNs作比较,确定了与ALS相关的病理表型。

参考文献:Kim BW, Ryu J, Jeong YE, Kim J, Martin LJ. Human Motor Neurons With SOD1-G93A Mutation Generated From CRISPR/Cas Gene-Edited iPSCs Develop Pathological Features of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 2020 Nov 19;14:604171. doi: 10.3389/fncel.2020.604171.

酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)如吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)对肺腺癌表皮生长因子受体(EGFR)突变有效。但癌细胞会在长时间接触这些药物后产生耐药性,超过50%的病例是由EGFR T790M突变引起。使用新药还会产生额外的耐药突变。研究人员通过CRISPR/Cas技术构建了PC9 T790M突变增强型细胞株,在PC9原有基础上提高了T790M突变比例,并且在等量吉非替尼暴露下,PC9 T790M突变细胞株耐药性更强,但对奥西替尼敏感性更强。因此利用CRISPR/Cas构建的点突变细胞株效率更高,更适用于三代EGFR小分子抑制剂筛选。

参考文献:Park MY, Jung MH, Eo EY, Kim S, Lee SH, Lee YJ, Park JS, Cho YJ, Chung JH, Kim CH, Yoon HI, Lee JH, Lee CT. Generation of lung cancer cell lines harboring EGFR T790M mutation by CRISPR/Cas-mediated genome editing. Oncotarget. 2017 May 30;8(22):36331-36338. doi: 10.18632/oncotarget.16752.
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