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基因治疗常用载体有哪些?AAV基因治疗前景如何?

基因治疗是一项前沿的医学技术,在多年的发展中,已经取得了许多重要的进展。然而,在现有的基因治疗技术中,仍然存在一些挑战和限制,例如短暂性的表达、免疫反应和安全性问题等。而AAV基因治疗正是针对这些问题而发展的一种新兴技术,它的出现有望重新定义基因疗法的未来

 

基因治疗(Gene Therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病,从而达到治疗疾病的目的。一直以来,传统大/小分子药物主要针对蛋白靶点发挥作用,这也使得其适应症有限,特别对于基因因素占据主要发病原因的遗传性疾病,无法有效发挥治疗效果。而这类基因相关疾病的患病人群其实并不小,例如罕见病,全球患者已高达3.5个亿,而80%的罕见病是单基因遗传病

 

治疗方式

研发难度

成功率

靶点范围

半衰期

特异性

基因治疗

较多

小分子药

较多

大分子药

较少

表1 几种治疗方式的对比

 

对于这些基因性疾病,目前的治疗方式有限,基本都是从改善症状的角度进行治疗,即治标不治本,患者的病症仍会不断进展并严重影响生活质量,甚至最终导致死亡。在此背景下,基因治疗应运而生,其可从根本病因上来治疗疾病,虽然基因治疗在20年前就有相关的临床应用案例,但其真正得到广泛研究和临床试验是从近几年开始。

 

基因治疗常用载体

基因载体,又称基因逆送载体,是将外源目的基因(或治疗性基因)导入宿主细胞进行表达,以研究基因功能或治疗疾病的工具,主要应用于细胞与基因治疗(Cell and Gene Therapy, CGT)、生物科研、生物制药、转基因食品等领域。

 

基因治疗通常可分为在体基因治疗和离体基因治疗。其中,在体治疗主要是将带有治疗基因的非病毒或病毒载体,如常用的腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV),直接递送到患者体内;而离体治疗则是在体外将治疗基因导入患者的细胞(常使用慢病毒LV),扩增后回输至患者体内。相比于离体治疗,在体治疗的方式对基因递送工具——即载体的要求更高

 

AAV基因治疗

在体基因治疗和离体基因治疗[1]

 

基因递送工具的选择是基因治疗中关键的一环,药物最终在人体发挥药效,很大程度取决于稳定、高效的递送系统。目前,基因治疗常用的载体包括病毒载体和非病毒载体,其中病毒载体由于其宿主范围广,作用时间长,在基因治疗研究中应用越来越广泛,可以进行编码基因或非编码基因的过表达、干扰、敲除和内源性激活等操作。

 

AAV基因治疗

基因载体分类

 

目前病毒载体中,常用的是AAV、AD、RV和LV四种,其中AAV因其具有较好的组织特异性、低免疫原性及高安全性,是目前在体基因治疗应用最广泛的递送载体。

 

项目

腺相关病毒(AAV)

腺病毒(Ad)

慢病毒(LV)

逆转录病毒(RV)

包膜

颗粒直径

18-26nm

60-90nm

80-130lnm

80-130nm

外源序列容量

<5kb

8kb

8-9kb

8kb

基因组

单链DNA

双链DNA

单链RNA

单链RNA

免疫原性

极低

中等

中等

安全性

 

低,系统给药可导致全身炎症反应,有致死病例

低,存在插入性致瘤风险

极低,存在插入性致瘤风险

宿主种类

非分裂细胞为主

分裂/非分裂细胞

分裂/非分裂细胞

分裂细胞

转导效率

中等

表达起始时间

体内7-14天开始表达,高峰期3-4周

1-2天开始表达

2-4天开始表达

2-3天开始表达

表达持续时间

>6个月/10年以上,不分裂细胞长期

2-4周

>2个月

>2个月

整合方式

定向低频整合(rAAV不整合)

不整合

随机高频整合

随机整合

表2 常用工具病毒特征对比病毒载体各类指标对比

 

腺相关病毒(AAV)

腺相关病毒(Adeno-Associated Virus)是一种无法自主复制、无包膜单链DNA病毒。具有以下几种优点:

安全性高:AAV病毒在人体繁殖的过程中不会导致疾病,且对人体产生的免疫反应较小,因此AAV基因治疗的安全性更高。

表达时间长:AAV病毒携带的基因可以在人体细胞内表达数年,从而实现长期治疗的目的。

应用范围广:AAV基因治疗可以用于改善和治疗多种不同类型的遗传性疾病。

 

目前,基因治疗临床试验采用的主要为重组腺相关病毒载体(rAAv)。它由非致病的野生型AAV基础上改造而成,只保留了两个反向末端重复序列(ITRs)将原基因组替换为目的基因,最大化携带目的基因的容量,并降低其免疫原性和细胞毒性。

 

AAV基因治疗

野生型与重组型AAV基因组结构示意图[2]

 

纯化后的AAV病毒载体可以用于感染细胞,感染细胞时,AAV衣壳蛋白与细胞表面特异性受体结合,激活胞内信号通路,进而触发AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞,在核内体、高尔基体等细胞器的协助下进入细胞核,而衣壳蛋白会被蛋白酶体降解。

 

AAV病毒载体一旦进入细胞核,就会脱壳并释放其单链基因组,并将其转化为双链DNA模板,在双链DNA模板上进行转基因的转录和翻译,从而实现目的基因的表达。

 

AAV基因治疗

AAV载体转录过程

(图片来源:Uresearch:全球CGT基因载体行业市场研究报告(2022-2026))

 

AAV基因治疗

AAV感染宿主细胞过程[3]

 

不同血消型的AAV具有不同的组织靶向特异性,目前已发现AAV有13种亚型近200多种变型,并逐步用于基因药物研发。AAV进入细胞的过程依赖于细胞表面糖基化受体识别AAV衣壳蛋白,因此AAV衣壳蛋白决定了其组织靶向的特异性。通过修饰、突变AAV的衣壳蛋白序列产生新的组织倾向性的AAV血清型,目前已发现AAV有13种天然血清亚型(AAV1-13),近200多种变型,每一种具有不同的组织趋向性,可靶向不同的组织。目前临床常用的有AAV2、AAV5、AAV8和AAV9等。

 

血清型

组织亲和性

AAV1

肌肉、心脏、骨骼肌(包括心肌)、神经组织

AAV2

中枢神经、肌肉、肝脏、脑组织、眼

AAV3

肌肉、肝脏、肺、眼

AAV4

中枢神经、肌肉、眼、脑

AAV5

肺、眼、中枢神经、关节滑膜、胰腺

AAV6

肺、心脏

AAV7

肌肉、肝脏

AAV8

肝脏、眼、中枢神经、肌肉

AAV9

心脏、肌肉、肺(肺泡)、肝脏、中枢神经

AAV-Rerto

神经系统(逆向非跨突触)

AAV-DJ

肝脏、视网膜、肺、肾脏

AAV-DJ/8

肾脏、眼、中枢神经、肌肉

AAV-RH10

肺、心脏、肌肉、中枢神经、肝脏

表3 不同血清型AAV的组织靶向特异性

 

AAV基因治疗前景

近年来,AAV基因治疗在临床和研究上取得了显著的进展,包括应用领域不断拓展、治疗效果的不断提升、治疗方案的不断创新等方面,被认为是基因治疗发展的重要方向之一。

 

从临床试验来看,以AAV为载体的基因治疗主要靶向眼部、大脑、肌肉和肝脏。一些研究表明,AAV基因治疗可以有效地治疗一些常见的遗传性疾病,同时AAV基因治疗在肝病、视网膜疾病、免疫疗法等领域也有着广泛的应用。它有望为治疗一些目前无法治愈的遗传性疾病带来新的希望。随着技术的不断创新和进步,相信AAV基因治疗将能够在未来重新定义基因疗法的未来。

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