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Molecular Cell:尚桂军/高福等团队合作揭示STING的自我抑制和激活机制

双链DNA(dsDNA)作为病原体入侵和细胞受损的信号,可激活机体的固有免疫反应。细胞内dsDNA的主要传感器之一是环状GMP-AMP合酶(cGAS),它以ATP和GTP为底物合成cGAMP。cGAMP作为第二信使,激活干扰素基因刺激因子(STING)。活化的STING从内质网向高尔基体转运,并激活TANK结合激酶1(TBK1)和干扰素调节因子3(IRF3),从而促进干扰素刺激基因的转录,最终形成抗感染的免疫应答。STING的异常激活与自身免疫性疾病和炎症性疾病有关因此,揭开STING的作用机制对于开发抗感染、抗肿瘤以及自身免疫性疾病的疗法至关重要。之前的多项研究揭开了STING的激活机制,但对STING的自我抑制机制仍知之甚少。

 

近日,山西高等创新研究院尚桂军团队、卢德芬团队与中科院微生物所高福团队、南方科技大学王培毅团队合作,深入分析了STING的自我抑制和内质网滞留机制。这篇发表在Molecular Cell上的论文描绘了一幅STING自我抑制和激活的全景图,大大加深了对cGAS-STING信号通路的了解。

 

STING的作用机制

图片来源:《Molecular Cell

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.03.029

 

研究材料与方法

在这项研究中,研究人员表达了多个物种(包括人类、小鼠、猪和鸡)的STING蛋白质,并通过冷冻电镜(Cryo-EM)分析了全长STING聚合物的结构。在分析某个氨基酸的改变对STING蛋白结构稳定性时,作者使用了多株基于CRISPR-Cas技术构建的THP-1/STING点突变细胞系,来模拟STING内源性突变对STING蛋白结构影响,THP-1/STING点突变细胞系由赛业生物提供。

 

技术路线

01 通过冷冻电镜等技术对apo-STING寡聚体的结构进行表征

02 通过共聚焦显微镜和突变分析来确定apo-STING中的关键结构

03 通过晶体堆积和冷冻电镜分析来确定STING-cGAMP的结构

04 比较STING在静息和活化状态下的结构

 

研究结果

1.apo-STING在LBD介导下形成双层结构

STING由N端的跨膜结构域(TMD)和C端的胞质配体结合结构域(LBD)组成。以往的研究发现,STING定位在内质网上,以同源二聚体的形式存在,而LBD处于开放状态。与cGAMP结合后,STING的LBD相对于TMD顺时针旋转180°,并形成一个盖子结构,将配体包在其中。分析还发现活化的STING形成更高阶的寡聚体,但STING-cGAMP复合物组装的细节仍不清楚。

 

内质网滞留对维持STING的非活性状态至关重要,而STING的异常转运会导致其以不依赖配体的方式激活。由于STING没有明显的内质网滞留信号,STIM1蛋白被认为是STING的结合伙伴,使其滞留在内质网上。近年来报道了几例婴儿STING相关血管病变(SAVI)患者,他们的STING被组成型激活。于是,研究人员想了解STING如何被抑制以及如何滞留在内质网上。

 

研究人员首先通过非变性凝胶电泳(native PAGE)实验,发现多个物种的STING在静息状态下以寡聚体形式存在。apo-STING(未结合配体的)寡聚体在非变性胶中不稳定,而cGAMP刺激能够提高STING寡聚体的稳定性。通过冷冻电镜分析,他们发现apo-STING表现出一种头对头和肩并肩的双层结构,像拉链一样将内质网两层膜连在一起(图1)。此外,这种类型的STING组装也出现在鸡、牛和猪等其他物种中,表明这种组装方式在进化上是保守的。

 

STING的作用机制

apo-STING寡聚体的结构[1]

 

通过对寡聚体结构的进一步分析,研究人员发现只有每个STING二聚体的LBD介导了相互作用,而TMD没有参与,彼此之间的距离约为15A°。LBD α2螺旋与α3螺旋之间的环(LBDα2-α3 loop)介导了apo-STING寡聚体的肩并肩组装。有研究表明位于STING二聚体的突变会以推动LBD的旋转,从而导致STING的异常激活,而引入外源点突变的STING很难解释这种现象,为了更好的确认这些位点突变的影响,作者委托赛业生物进行THP-1/STING点突变细胞株的构建,模拟STING内源突变是否导致会以不依赖cGAMP的方式激活STING。

 

将Q273残基突变为E273残基后,研究人员发现STING通路的基础磷酸化水平要高得多,且IFN-β活性升高,即使没有cGAMP的刺激,STING foci的形成也会增加。当S275突变为N275时,蛋白变体在没有cGAMP的情况下变得高度激活,表明这一替换极大破坏了STING自我抑制构象的稳定性。这些结果显示,LBDα2-α3 loop在维持STING的自我抑制方面起着重要作用

 

在头对头的STING相互作用中,由残基L230和P231组成的疏水性LP motif发挥了关键作用。令人惊讶的是,他们发现非活性状态的STING采用了一种封闭构象,带有一个盖子,与以往的开放构象形成了鲜明的对比。其中,一个单体内的LP motif由于翻转90°导致盖子区域内经典LBDβ2-β3 loop中的返回链与非经典LBDβ2-β3 loop中的起始链之间形成平行β折叠片层结构,而不同于结合cGAMP后的反平行β折叠片层结构(图2)。这种由LP motif和LBD的疏水裂隙介导的头对头相互作用将STING的两层粘在一起

 

STING的作用机制

apo-STING双层的头对头相互作用[1]

 

2.STING-cGAMP复合物的结构

此外,通过晶体堆积分析和冷冻电镜研究,研究人员发现STING-cGAMP复合物通过肩并肩堆积形成了多聚结构(图3)。高分辨率的电镜图像显示,STING-cGAMP复合物的整体结构从侧面看呈弯曲状。其他多个物种的STING-cGAMP复合物结构也类似,表明这种构象在进化上是保守的。相邻的STING二聚体之间的相互作用不仅发生在LBD上,也存在于TMD之间。

 

STING的作用机制

STING-cGAMP复合物的整体结构[1]

 

3.STING非活化和活化状态的结构比较

根据前面的分析,STING在静息和活化状态下都能形成寡聚体,明显的区别在于,自我抑制的STING形成了双层丝状结构,而活化的STING则形成弯曲的单层丝状结构。STING的静息状态是由LBD通过顺式和反式的头对头和肩并肩堆积来维持的,而STING的活化状态则仅通过顺式LBD和TMD的相互作用来稳定。尽管STING的两种状态都采用封闭构象,但这两个盖子的构象是不同的(图2)。

 

在比较两种状态下的结构后,研究人员认为弯曲的STING寡聚体可以使内质网膜变形,并推动STING向前运输。相比之下,在静息状态下,STING的双层结构让两层平行的内质网膜紧密接触,使得STING滞留在内质网中。这些结果表明,apo-STING寡聚体结构代表了STING的自我抑制状态,而LBD在维持其自我抑制方面起了重要作用

 

研究结论

综上所述,研究人员发现apo-STING在静息状态下形成双层结构的寡聚体,将内质网的两层膜连在一起,STING据此完成了内质网滞留和自我抑制。活化的STING则采用弯曲的构象,使内质网膜变形,便于其前向运输。这种自我抑制和活化的结构为人们了解STING的生理和病理作用提供了大量信息,并为合理设计药物以控制STING活性提供了可能

 

原文检索:

[1]Liu S, Yang B, Hou Y, Cui K, Yang X, Li X, Chen L, Liu S, Zhang Z, Jia Y, Xie Y, Xue Y, Li X, Yan B, Wu C, Deng W, Qi J, Lu D, Gao GF, Wang P, Shang G. The mechanism of STING autoinhibition and activation. Mol Cell. 2023 May 4;83(9):1502-1518.e10. doi: 10.1016/j.molcel.2023.03.029.

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