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上篇——慢病毒包装,这可能是你最关心的问题

慢病毒包装,这可能是你最关心的问题

 

慢病毒(Lentivirus,LV)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)改造而来的一种病毒载体,属于逆转录病毒。慢病毒可将特定基因片段随机、稳定地整合到宿主细胞的基因组中,实现目的基因的持续稳定的表达目的产物,因此,目前慢病毒载体已经广泛地应用于基因的表达调控如过表达,干扰和基因敲除。

 

然而,在做病毒包装实验中,科研工作者常遇到一些问题,比如为何我的LV包装出毒量很低?包装出来的LV感染细胞效率低?感染细胞后生长状态差等,下面就由赛业生物细胞生物学产品经理为大家解答这些常见的问题。

 

为何我的LV包装出毒量很低?

为什么都是采用同样的慢病毒包装系统,别人次次成功,我的不是滴度低就是稳定性差?这是因为除了包装系统本身,LV的包装还与下列几个因素密切相关:

 

1) 细胞状态:LV的包装一般使用293T细胞,293T细胞的活力、生长状态,是否处于对数生长期、铺板是否均匀等对病毒的产量影响很大,并控制转染前密度为50~60%。

 

2) 目的基因:目的基因的大小、序列及翻译的蛋白是否含有毒性均会影响包装效果;例如,若目的片段较大(>2.5k),则可能会导致包装滴度下降,甚至无法包装。某些过表达会产生细胞毒性的蛋白,可能会导致细胞异常从而出毒量低(可考虑更换为腺病毒)。

 

3) 质粒质量:做好阴性对照(GFP组),确保包装目的基因的载体构建的完整性,并做好纯化。

 

4) 收毒时机:转染后24、48h观察细胞生长状态及荧光状态,生长状态良好一般于48h第一次收集病毒上清,换液后于72h再次收集病毒上清。

 

包装出来的LV感染细胞效率低?

理论上LV感染细胞的能力很强,而且能感染分裂和非分裂期的细胞,但为什么我的感染效果总是不理想?影响LV感染效果的因素有哪些?

 

1) 细胞类型:有些细胞本身就较难被感染,如某些原代细胞,可考虑加大病毒量或采用浓缩病毒进行感染。

 

2) 细胞生长状态:感染细胞前,需要保证细胞处于良好的生长状态,以及合适的生长密度,细胞膜的流动性、与细胞表面的接触面积及表面受体的表达丰富等均会影响病毒感染细胞的效果;另外对于悬浮细胞,可以采用离心感染的方法。

 

3) 病毒质量:包装出来的LV应尽量避免冻融,反复冻融会降低病毒的滴度(每次约降低10%),若一次用不完建议分装后储存于-80℃,但即使-80℃也不建议超过6个月;对于4℃保存的LV则尽量3天内用完。

 

另外,也可考虑加入Polybrene助感染试剂增强感染效果,但Polybrene本身具有细胞毒性,谨慎使用。

 

细胞感染后生长状态差?

我们用LV感染细胞是为了进行后续一系列的功能研究,结果感染后细胞生长状态很差完全无法继续实验,这是什么原因?有什么办法呢?

 

1) 纯化病毒:病毒溶液中残留的杂质蛋白、内毒素及宿主细胞DNA等都有可能造成细胞毒性,严重时可能导致细胞死亡。

 

2) 调整病毒滴度:MOI值是LV感染实验非常重要的一个指标,我们应在确保细胞状态不受影响的情况尽可能用最少的病毒量。某些对病毒比较敏感的细胞,过高的滴度会严重影响细胞状态,可通过预实验,确定病毒感染的最佳MOI值。

 

3) 外源基因过度表达:如果过度感染使得外源基因过度表达,可能导致目的细胞代谢失衡从而影响生长状态。

 

如何确定慢病毒MOI值?

MOI即感染复数,一般将细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的MOI。MOI值=病毒滴度(TU/mL)×病毒体积(mL)/细胞个数

 

1) 查文献:通过高分文献报道确定MOI值。

 

2) 设计梯度预实验摸索:以文献推荐梯度上下各设置2个梯度,每个梯度至少相差两倍,例如文献推荐MOI值为8,则设置为2-4-8-16-32。

 

3) 梯度感染后,选取细胞状态较好、荧光较多的,或者药物筛选后细胞存活率较高的梯度作为使用的MOI值。

 

怎么检测慢病毒滴度呢?

滴度(Titer):单位体积中有感染能力的病毒数目;单位:TU/mL(活性滴度单位)。

 

通常来说LV滴度检测:越准确,就越花时间;越省事的,就越不准确。根据并不是所有的实验要求都需要精确检测,例如对于构建基因稳定过表达或干扰表达(shRNA)的细胞株,由于有后续的筛选的过程,就可采取快速检测法(死病毒也会检测出来)。

 

LV滴度的快速检测包括QPCR,ELISA和试纸法。其差异在于,QPCR法:检测病毒核酸量;ELISA法:检测病毒衣壳蛋白量;试纸法:检测病毒p24衣壳蛋白含量。

 

而对于做RNAi-screening或CRISPR-screening等研究,则需要精确检测LV的滴度,包括荧光报告基因法和抗生素筛选法。

 

为什么我用LV做基因的干扰表达效果不好?

对于干扰慢病毒,提高病毒量对干扰效果一般不会有改善效果。干扰效果差一般来说是由以下几个原因导致的:

 

1)shRNA的特异性:shRNA设计而导致的脱靶效应,重新设计shRNA。

 

2)干扰机制:促进mRNA降解还是抑制翻译?

 

3)细胞反馈机制:某些基因表达水平降低会导致核糖体翻译效率上升,表达水平上升。

 

4)结果判读建议以蛋白为准。

 

LV过表达效果差?

在我们用LV进行过表达时,常出现以下2种情况:

 

1) 目的细胞无荧光信号但平行293细胞有信号。出现这种情况最可能的原因为目的细胞不易感,属于难感染细胞,建议适当加大病毒量再尝试。

 

2) 目的细胞有荧光但目的基因表达无增强。说明转染没问题,且荧光启动子正常工作,若目的蛋白与荧光蛋白是否为同一启动子,包装前可做启动子活性筛选;另外,考虑目的蛋白是否对细胞有毒性,使得目的蛋白被细胞降解。

 

另外,对于过表达效果差的一般处理办法,可采取:提高病毒滴度、更换载体、避免基因反馈(细胞适应)、以及采用诱导表达的方式。

 

LV如何介导多个基因同时表达?

1) 若目的基因片段不大,可采用双向/多启动子分别单独启动多个基因。

 

2) 若目的基因片段较大,可采用单一启动子启动多个基因表达(蛋白融合)。

 

3) 在不同基因间插入IRES。

 

4) 在不同基因开放阅读框中插入蛋白酶剪切位点。

 

你的问题是否已经得到了解答。如果你还有其他问题需要解答,欢迎在评论区给我们留言,我们下期统一为大家解答哦~

 

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