Cre-loxP位点特异性重组系统在小鼠条件性靶基因功能研究中的应用

基因编辑小鼠模型是当今研究基因功能和致病机制的利器。业界重量级资深技术大咖为您详细解析：为何应充分了解与关注基因编辑小鼠模型应用中存在的某些风险与影响因素，如何设计有助于提升基因编辑小鼠模型研究结果的准确性与可靠性。精彩好文，全是干货，不可错过！ 

作者简介：

俞晓峰 博士

赛业生物首席科学家、副总裁

俞晓峰博士现为赛业生物首席科学家与副总裁，负责基因修饰模式动物的研发与技术服务等。俞博士在基因修饰模式动物领域有超过20年以上研发与管理等方面的丰富经验，在干细胞相关领域及哺乳动物细胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次发表在Nature Immunology、Hum Mol Genet.、Mol Cell Biol.等高水平杂志上。

加入赛业生物前，俞博士于2010-2013年任职于美国应用干细胞（ASC）公司，担任研发总监，负责基因修饰模式动物的研发与定制服务，并任中国子公司斯坦福生物科技公司副总裁。2009-2010年任纽约大学医学院研究员。2003-2009年任职于美国基因打靶公司（iTL），作为资深科学家和项目经理，负责及参与基因修饰小鼠模型研发与定制技术服务的策略与方案设计、项目管理、技术人员指导与培训、客户服务与技术咨询等工作，2007年负责开发了人源化p53基因突变的肿瘤小鼠模型库构建项目。2000年任美国耶鲁大学医学院研究员。1995年获得军事医学科学院博士学位。

前言

应用基因编辑小鼠模型研究基因的功能、揭示疾病致病机制过程，为药物研发的临床前研究，发挥了不可取代的作用。而Cre-loxP位点特异性重组系统（简称Cre-loxP重组系统）的建立，为完善基因编辑小鼠模型的构建，进一步开展条件性靶基因功能的研究，提供了有效工具。回顾Cre-loxP重组系统在小鼠研究中的实际应用，研究者们认识到，对该技术应用中存在的某些风险与影响因素，给予充分了解与关注，将有助于提升靶基因编辑小鼠模型研究结果的准确性与可靠性。

一、Cre-loxP位点特异性重组系统应用基本原理

所谓Cre-loxP位点特异性重组系统，源于噬菌体P1中，存在Cre重组酶（343个氨基酸蛋白，4个亚单位组成）及其能特异识别的一对34 bp的DNA序列（即loxP位点），并根据两个loxP位点的方向性，将两loxP位点之间的DNA序列（也称floxed区域）进行特异性重组切割或反转。 

如果在相应细胞/组织内特异性表达Cre重组酶,  且细胞/组织内也含两个loxP位点序列的floxed靶区域，则可使Cre-loxP系统的重组作用，局限于特定细胞或组织，实现体内靶基因特异性敲除或表达的目的。 T细胞特异性Cre转基因小鼠最先构建，为条件性靶基因在T细胞中的功能研究提供了条件。

二、应用Cre-loxP位点特异性重组系统，实现小鼠条件性靶基因功能研究

要想实现小鼠条件性靶基因编辑及功能相关研究，前提是分别获得两种小鼠模型：即构建含两个loxP位点序列floxed靶基因的小鼠和细胞/组织特异性表达Cre小鼠。比如，为了开展某靶基因的条件性敲除（CKO)研究, 首先要构建该靶基因的打靶载体，即将两个loxP位点分别克隆到该靶基因DNA区域的两端，再借助CRISPR/Cas 受精卵注射或赛业生物TurboKnockout囊胚注射技术，建立所谓的靶基因floxed小鼠，即小鼠模型在某靶基因计划敲除的特定floxed区域，已经携带了两个同向的loxP位点。将该floxed小鼠与某特定细胞/组织特异性表达的Cre小鼠进行交配，就能获得该靶基因在此特定细胞/组织敲除的小鼠模型。

最终完成Cre-loxP系统条件性靶基因编辑小鼠研制的操作，通常需要通过floxed小鼠与相应Cre小鼠间的两步遗传交配繁殖过程。第一步交配，X基因Cre杂合小鼠（X基因Cre/+）与Y基因 floxed杂合小鼠（Y基因 lox/+，即CKO打靶Y基因)，或Y基因 floxed纯合小鼠（Y基因lox/lox）交配，获得X基因Cre/+; Y基因lox/+ 后代杂合小鼠。第二步交配，将X基因Cre/+; Y基因lox/+杂合小鼠，再与Y基因lox/+杂合小鼠，或Y基因lox/lox纯合小鼠交配，从而获得最终X基因Cre/+；Y基因lox/lox条件性打靶小鼠。

如果Cre表达是严格调控的，且无生殖系统或发育过程表达现象，第二步交配的后代小鼠, 只有X基因Cre/+; Y基因lox/lox小鼠，可作为条件性靶基因打靶的小鼠模型研究，即Y基因的两个等位基因，在Cre重组酶特异性表达活性的组织细胞中，被有效重组切割的目的。

然而，如果Cre存在生殖系统泄露表达情况，在第一步交配后，有可能对X基因Cre/+; Y基因lox/+杂合小鼠，进行生殖性重组切割作用，产生X基因Cre/+; Y基因Δ/+小鼠（Δ代表Y基因某个等位基因在某些细胞或所有细胞敲除），这样的话，第二步交配，就是X基因Cre/+; Y基因Δ/+杂合小鼠，与Y基因lox/+杂合小鼠，或Y基因lox/lox纯合小鼠进行交配。如果此时，还是用常规两个引物的PCR鉴定策略，很难鉴别出非预期的生殖系基因敲除现象，必需借助设计三个引物组合的PCR鉴定策略加以确定。

三、不同Cre小鼠模型构建策略及方法特点

目前有四种常见Cre小鼠模型构建策略及方法，虽然每种方法都有其优势与不足，也很难说那种策略方法，能够适合或满足所有研究目的。所以，最终选择哪种方法，还是要根据研究目的具体情况决定。 

1. 质粒表达载体的转基因Cre小鼠模型：认为是Cre小鼠构建的传统方法，因为最初的Cre小鼠模型，多是应用特定启动子加Cre基因cDNA的质粒载体，通过受精卵原核注射法，获得Cre随机插入基因组的转基因小鼠。 

由于启动子大小的限制，只选择了一定范围的表达调控元件序列，构建Cre表达载体，加上转基因随机插入基因组的位置效应影响、拷贝数的差异、以及内源基因可能破坏等因素，使每个Cre首建鼠存在个体差异，且需要通过对每个首建鼠特征进行筛选与鉴定，获得特定理想的Cre转基因小鼠模型。 因此，通过传统转基因技术构建的Cre小鼠模型，出现所谓Cre作用的“脱靶（off-target）” 活性，也就不奇怪了。

2. 定点敲入Cre小鼠模型：将Cre基因定点敲入相关内源基因位点，借助内源性基因调控序列确定Cre表达特征，已成为传统转基因Cre小鼠构建的替代选择，也增加了Cre基因表达活性的精确性。

应用CRISPR/Cas或赛业生物TurboKnockout的ES打靶技术方法，将单拷贝Cre定点敲入相关内源基因位点，按以下几种策略方式敲入：（1）. 特定内源基因翻译启始位点; （2）. 借助IRES序列连接，将Cre基因敲入内源基因的3’ UTR区域；（3）. 借助2A“自切割”肽连接，将Cre基因替换并敲入内源基因的终止密码处。

一般而言，直接将Cre敲入特定内源基因的翻译启始位点的策略，往往会同时破坏了该基因的表达。有研究发现，因Cre敲入到生长发育或疾病通路等至关重要相关基因中，导致相应Cre小鼠，出现影响基因功能的潜在非特异性表型。比如，Foxg1-Cre敲入小鼠模型，杂合Cre小鼠即出现小鼠前脑发育障碍。所以，该策略只适合于哪些杂合缺失无表型的相关基因。而应用IRES和2A敲入策略，避免了由Cre特定位点敲入，可能引起的杂合缺失表型的不足。

关于IRES与2A肽两种连接敲入策略的比较，通常认识是，传统的IRES敲入策略，几乎不会影响内源基因的功能，但也发现，由于传统经典的ES打靶过程中，Neo基因表达成分，或去除其后遗留的相关FRT序列等遗留部分序列，可能会引起内源基因3’ UTR区域结构改变，从而干扰了Cre的表达水平，使其实际表达量会相对低于内源基因本身。而新型2A肽连接敲入方式，Cre表达量与其内源基因表达几乎相似，但由于切割2A肽后，遗留的约17-21氨基酸序列，可以附着于内源基因c-端蛋白，存在潜在影响内源蛋白功能的可能性。已有研究表明，不同的2A肽序列 (P2A, T2A, E2A, F2A) 具有不同自切割效率。 尽管如此，应用敲入3'端策略，已不断赢得其吸引力。

3. BAC转基因Cre小鼠模型：将Cre基因先敲入至BAC克隆的特定基因调控元件序列后，构建BAC克隆载体，并将此BAC载体进行受精卵原核注射法，构建BAC转基因Cre小鼠模型。虽然该转基因技术也是随机整合插入，但其具有降低了质粒DNA随机插入引起的位置效应影响，避免了Cre基因5’ 端敲入可能引起的杂合缺失有表型等方面的优势。另外，相对于短启动子的表达质粒转基因而言，BAC载体包含了更多的基因表达相关的调控元件序列，因而更能反映内源基因的表达特征。但是，BAC转基因的首建鼠，仍会出现因BAC克隆载体插入位点的不同，而引起Cre表达活性不同的现象。因此，该方法并不能解决传统转基因技术的所有不足，比如，插入位点染色质结构的局部影响作用，以及潜在基因插入突变，造成Cre非真实表达等风险。而且，在BAC转基因Cre小鼠构建的同时，也可能增加了附带相应基因的拷贝数，从而干扰了相关基因功能研究的客观分析。尽管如此，相对于传统较小启动子的Cre表达载体而言，BAC转基因技术还是具有其明显的优势。

4. 安全位点敲入Cre小鼠模型：目前最新的Cre小鼠模型构建策略。为了避免基因随机插入可能导致诸多不利因素影响（比如表达位置影响作用及插入突变等），通过将Cre定点敲入到所谓的“安全” 位点，比如 Rosa26、Hprt 和 Hipp 11等位点。其中以Rosa26位点最为常用。

Rosa26位点特点，其本身含有基因转录的广泛启动子，形成mRNA，却无翻译蛋白。所以，该基因无特定功能。借用该基因位点本身的特点与优势，有助于构建全身表达Cre基因单拷贝定点敲入小鼠模型。而Hprt和Hipp11位点则比较适合构建组织特异性敲入Cre小鼠模型。 

四、为什么要构建诱导性调控CreERT小鼠模型及其基本特征

前面介绍的Cre小鼠模型，其作用特异性及特征，是由引导Cre表达的基因启动子特征或构建策略方法决定的。由于许多所谓特异性基因的表达，贯穿了整个细胞/组织的胚胎发育成熟过程。而由这类基因特性启动子构建的所谓细胞/组织特异性Cre小鼠，其Cre活性作用，可能始于小鼠的胚胎时期。如果研究的靶基因又是小鼠生长发育非常重要的基因，过早实施Cre-loxP重组系统作用，有可能导致胚胎发育期靶基因的敲除，产生生殖系基因敲除小鼠的结果，也就难以实现细胞组织的特异性敲除靶基因的目的。所以，如何控制Cre表达的时间，使其成为可被诱导调控，即通过使用诱导物的方式，可以掌控Cre表达时间，结合细胞/组织特异性Cre特征，达到时空条件性靶基因敲除/表达的研究目的。

所谓可诱导性调控CreERT系统，是将Cre基因与雌激素受体（ER）配体结合域突变体（ERT）融合一起构建而成。该ERT只与合成的ER配体结合，比如4-羟基他莫昔芬（为药物Tamoxifen的活性代谢物）。 在无该诱导剂存在下，CreERT融合蛋白与细胞浆中HSP90结合，以非活性状态存在于细胞浆，无法发挥Cre-loxP重组系统作用。当对CreERT/floxed小鼠体内提供药物诱导剂Tamoxifen (TAM），Cre蛋白与HSP90蛋白分离，进入细胞核，识别靶基因中的loxP位点，发挥Cre-loxP位点细胞/组织特异性及时间特定的重组切割作用。

CreERT小鼠为雌激素受体配体结合域中只有一个突变位点（G521R），目前常用的CreERT2小鼠，则是在相应配体结合域中引入3个突变位点（C400V/M453A/L544A), 大大提高了其对诱导物TAM的敏感性与特异性。

在特定时间和部位发挥诱导Cre-loxP重组切割作用能力，无疑极大提高了实验研究的灵活性。同时也增加了研究者实际应用该诱导性Cre-loxP特异性重组系统的挑战性，比如，对于该系统可能出现的包括Cre泄露表达作用，以及可能的毒性作用等，都需要研究者在实际应用中倍加谨慎小心。

五、Cre转基因小鼠模型中Cre插入位点鉴定的挑战与重要性

目前常用的Cre小鼠模型中，采用传统转基因策略构建的小鼠模型仍是占比最大。然而，对于转基因小鼠模型中，基因随机插入位点的相关鉴定研究占比非常少。有分析数据表明，只有不到5.2% ( 416/8012 ) 转基因小鼠模型，研究报道了基因随机插入的位点，而其中只有约2.3%（36/1631）转基因Cre小鼠品系，明确分析了其插入位点，提示分析鉴定转基因随机插入位点所面临的挑战性。 

为什么需要鉴定分析转基因随机插入位点？第一，有利于转基因小鼠特定基因型引物的设计，便于纯合Cre小鼠的鉴定；第二，有助于条件性靶基因实验研究中，相关基因型鉴定分析策略及特异性PCR引物设计；第三，了解可能潜在的插入突变引起的非期望表型，比如随机插入导致的直接或间接的内源基因编码序列，或附近相关调控序列的破坏改变，以及引起反转/复制等的复合结构改变等。

应用靶向位点扩增（Targeted locus amplification -TLA）技术，能有效分析鉴定随机转基因插入位点与插入基因性质特征。 有研究者应用该技术，对选择的40多种常用的转基因Cre小鼠模型，进行分析研究发现，有30种Cre小鼠模型，由于基因的随机插入，导致了相应基因组结构性变化，其中包括24种小鼠出现基因结构的缺失，6种出现结构重复。 50 % 转基因Cre小鼠内源性基因受损，且多表现为DNA大片段缺失和/或插入位点相关基因结构改变。由于随机插入导致的基因结构改变，可诱发非期望的相关表型，从而影响到Cre-loxP重组特异性靶基因实验结果的准确性。

六、Cre-loxP位点重组系统应用中常见风险及影响因素

Cre小鼠模型作用的一致性与可重复性，是分析解释实验结果可靠性的保证。然而，回顾过去研制的一些Cre小鼠模型，观察分析其实际应用中的情况发现，不少所谓特异性Cre小鼠模型，其Cre的靶基因切割活性，明显存在不均匀和/或不一致的现象。比如，MMTV-Cre、Krt19-Cre、Gata4-Cre和Nes-Cre/ERT2小鼠等, 都报道有不同程度泄露表达等非特异性作用效果。 

某些Cre小鼠模型，常出现Cre非特异性/非预期/异位等异常表达现象， 从而影响表型结果分析及解释的准确性。比如，Myh6-Cre、Ins2-Cre、Vil-Cre、Ddx4-Cre和Pdx1-Cre等。也有些Cre小鼠模型表现有生殖系细胞作用活性，从而引起Cre-loxP重组系统的广泛而非特异性的切割作用。

关于Cre小鼠的所谓非特异脱靶重组作用的原因，目前多认为，与如下因素有关，第一，应用不同的Cre小鼠构建策略与技术；第二，Cre小鼠起初研制的时候，研制者很明确其实际应用的特殊目的，从而导致对Cre小鼠特征鉴定的关注点存在偏差，忽略了对其进行全面完整而系统的相关分析。然而，当这些Cre小鼠模型成为公共应用资源后，由于研究者们的广范围应用，也使人们有更多机会对其期望作用的靶组织，以及作用范围区域和多个时间点的细胞/组织类型等重组切割活性，进行更加精确及深入的实验研究。

Cre小鼠令人困惑的潜在非特异性作用的脱靶活性风险，以及引起可能的毒性作用，不仅可导致靶基因敲除小鼠的死亡，或非靶基因敲除引起的非特异性表型。由于这类Cre小鼠引起的脱靶活性作用，其实已代表了Cre的真正活性作用，自然也限制了这类小鼠模型，未来进一步应用的价值。

1. Cre非特异性/错误重组作用/随机插入突变的影响因素

目前常用的Cre小鼠模型多为传统转基因技术构建，即采用所谓细胞/组织特异性的启动子部分DNA片段策略，加上基因随机插入，可能产生所谓的基因表达位置效应等特征，造成Cre表达的不准确或泄漏，难以真实反映真正期望的特异性，导致Cre表达出现脱靶切割作用。

有研究通过分析常用的几种胸腺特异性Cre转基因小鼠模型（比如Lck-Cre, CD2-Cre和CD4-Cre）的非特异性作用时发现，虽然这些小鼠均是应用胸腺特异性启动子构建的，但Cre表达，可导致小鼠胸腺细胞量中等或严重程度的减少，且表现有剂量和拷贝数量依赖的特征。

由于Cre重组酶非特异性识别并作用于基因组中与loxP位点相似的序列，也称隐秘loxP（cloxP) 位点，引起Cre-cloxP位点的非特异性重组切割作用，从而有可能导致重要或关键基因破坏，轻则引起非特异性细胞表型，重则研究组织器官破坏或小鼠死亡。 

对Tek-Cre小鼠模型进行基因插入位点分析研究表明，由于Cre的随机插入，导致241-kb大小DNA缺失, 影响到相关蛋白编码基因（比如Mtrr、Fastkd3和Adcy2等）表达， 且小鼠出现发育异常的表型，而该表型可能与Mtrr基因的缺失有关，因为Mtrr基因敲除小鼠，即可导致后代小鼠发育严重障碍。

另外，在分析某些Cre转基因（比如Ins2-Cre、Nes-Cre、Alb-Cre和Lck-Cre）小鼠模型也发现，某些非预期DNA成分出现，比如，人生长激素 (hGH) 微小基因片段。并观察到Nes-Cre和Ins2-Cre两种小鼠品系都出现代谢方面的明显表型，且Ins2-Cre小鼠出现不明原因的，与年龄相关的糖耐受异常。但Alb-Cre和Lck-Cre两种小鼠品系，却未见相似表型。表明hGH微小基因在不同转基因小鼠中，可表现不同的表达及影响作用。

也有报道发现，在分析的40种转基因Cre小鼠模型中，有10种Cre小鼠伴随有E.coli DNA序列的污染，DNA片段大小由～300 bp到超过200 kb。且证实，小DNA片段与克隆载体如pBACe3.6相同。出现细菌和载体DNA相互污染的推测原因，可能与注射载体DNA制备过程有关。但关于此类污染的影响作用，目前还不太明确。但有研究报道，细菌DNA序列可沉默及影响转基因的表达。

一般认为，随机插入转基因构建Cre小鼠模型的策略与技术，存在许多不确定的风险。比如，Cre随机插入，干扰附近内源基因表达水平，从而导致Cre作用的所谓脱靶表达现象。

即使应用定点敲入策略构建Cre小鼠模型，也可能造成相应基因表达影响，导致该小鼠模型出现一定的病理改变表型。特别是采用将Cre敲入内源基因的5’端构建策略。比如，Foxg1-Cre敲入/敲除小鼠，就是在Cre敲入内源性Foxg1基因位点同时，也敲除了该基因，而 Foxg1基因参与小鼠大脑半球发育过程，所以，该Cre纯合子小鼠在围产期死亡。 虽然，Foxg1- Cre杂合小鼠，仍可发挥脑部组织特异性靶向作用，实现小鼠大脑半球、视前/视囊泡、嗅觉上皮神经和咽囊部等部位靶基因特异性敲除的目的。 

2. Cre重组酶高表达的毒性作用

Cre重组酶在细胞内的大量蓄积，可直接引起DNA破坏及细胞死亡。研究已表明，对于高表达Cre的转基因小鼠，表现为其存活及繁殖能力降低。CAG-Cre和CD2-Cre小鼠模型就是典型例子。

Myh6-Cre小鼠是心肌特异性常用小鼠模型, 借助aMyHC启动子及随机插入转基因的策略构建而成。对比小鼠Cre不同表达水平的影响作用发现，Cre高表达小鼠发生非特异性重组作用，从而影响到小鼠心肌的正常功能。而Cre低表达转基因小鼠，则无非特异性重组作用。研究者认为，高表达的Cre与小鼠体内某些所谓隐秘loxP(cloxP)位点，发生非特异性的重组切割效应，达到破坏相关基因功能的作用。

神经元细胞中高表达的Cre可引起小鼠脑发育受损。研究分析Nestin-Cre和两个Nestin-CreERT2转基因小鼠品系证实， 所有纯合Nestin-Cre 小鼠，都有胚胎发育延迟及神经元增殖降低、异倍体增加与细胞凋亡病理现象、最终导致小鼠小脑症和脑积水等发育缺陷表型。

高水平Cre表达也可直接影响视网膜色素上皮细胞功能。比较分析不同视网膜色素上皮细胞 (RPE) 特异性Cre转基因小鼠后发现，常用Trp1-Cre转基因小鼠本身，就伴随RPE单层细胞结构混乱、RPE区域萎缩、视网膜感光细胞功能丧失、以及小胶质细胞激活等病理变化。

作为代谢性疾病常用的RIP (Ins2)-Cre小鼠，也见有糖耐受反应或诱发糖尿病发生，并推测可能与胰岛素分泌受损有关。

有报道表明，诱导性肠特异性Villin-CreERT2小鼠，经TAM激活后，可借助隐秘loxP位点，引起非特异性DNA破坏作用。

3. Cre生殖系重组作用与小鼠性别影响

通过对64种不同神经系统相关Cre小鼠模型研究发现，有64.1%小鼠有生殖系重组作用，且29种(占82.8%) 有性别差异，其中父本Cre小鼠有完全或选择性生殖性重组活性作用占62.1%，而母本Cre小鼠则只占20.1%。只有17.2%的Cre小鼠，具有相似的生殖系重组作用。 比如，Foxg1-Cre/floxed 双基因编辑雄性小鼠与野生雌性小鼠交配的后代，会出现有一定程度生殖细胞基因敲除现象（68.8%），但未见Foxg1-Cre雌性小鼠的生殖细胞作用。

分析这些Cre小鼠出现生殖系重组作用的可能原因及其影响因素，包括小鼠模型构建策略技术本身，比如，转基因还是定点敲入策略、启动子的选择、Cre插入位点及表达水平、5’ 端还是3’端敲入、IRES与2A连接方式等都可为潜在影响因素。比如，所谓内皮细胞特异性Tek-Cre (Tie2-Cre)转基因小鼠模型，多是借助Tek基因的2.1 kb启动子加10 kb内含子片段区域构建而成。结果发现，该Cre表达活性出现于小鼠胚胎7.5天，且表现一定程度造血干细胞系的重组活性。且母本小鼠显示有明显的生殖系重组作用。现已证实，因Tek基因调控序列在胚胎发育过程及生殖系细胞具有活性作用，从而引起了靶基因在生殖系被敲除的结果。

4. Cre作用的镶嵌现象 (Mosaicism)  

由于变化或不一致的Cre表达作用，导致同一小鼠体内不同细胞或组织中，Cre重组切割作用活性及效率表现差异，因而引起靶基因在不同细胞或组织被敲除的效果，呈现不一致的现象。比如，Vav1-Cre或Fabp4-Cre小鼠品系，其Cre小鼠作用的子代同窝小鼠中，因Cre作用引起的遗传改变相关表型，也存在差异的可能性。另外，EIIa-Cre小鼠作为常用的广泛细胞组织靶基因完全敲除的工具，实际应用中也被证实，雄性Ella-Cre小鼠明显有镶嵌表达的特性，而雌性Ella-Cre小鼠的重组切割活性, 则更加均匀一致。因而建议用雌性Ella-Cre小鼠与条件性靶向(floxed) 雄性小鼠进行交配，以获得更为理想而完整的重组切割效果。

5. 小鼠遗传背景影响作用

研究已发现，不同遗传背景的同一Cre小鼠模型，其重组切割活性作用也可不同。比如，眼睛特异性Le-Cre转基因小鼠所引起的眼睛异常表型，就与其遗传背景的影响有关。当该Cre小鼠常用FVB/N品系与CBA/Ca遗传背景小鼠交配7代后，部分CBA/Ca品系的Le-Cre小鼠，出现明显眼睛异常表型。且CBA/Ca品系小鼠眼睛表型的严重性及出现频率，也可通过回交FVB小鼠2代而逆转消除。

6. TAM应用中相关问题

CreERT2-loxP位点特异性诱导性重组系统，需要诱导剂TAM参与完成。然而，实际应用中，有许多因素可影响其作用效果，并可能引起非特异性及相关毒副作用，则应加以了解关注与重视。

（1）关于TAM有效诱导的最优剂量与途径

通过对已报道的CreERT小鼠品系应用研究分析中，寻找最佳TAM诱导有效性是比较困难的，部分原因是因为不同研究，应用了不同的实验方案策略与操作流程，包括多种不同的TAM制备及使用剂量，各种给药途径等。比如，Columbia大学对相关研究者们的问卷调查表明，TAM制备方法（玉米油配制为多，其次为向日葵油和花生油等）、使用剂量（20mg～175 mg等）、给药途径及次数（腹腔注射最多，包括有单次、2-4次和5次等，其次为口服灌胃等）、以及诱导效果检测方法（RT-PCR和免疫荧光染色为主）等均有明显不同。

虽然，目前大部分研究都是采用TAM腹腔注射（IP）给药的方式，但也有研究比较了IP给药与口服灌胃（PO）给药方式效果，发现PO方式在降低TAM毒性方面，可能更有优势。且发现老年CreERT小鼠，往往需要更高剂量与更长时间TAM诱导，以获得满意的CreERT作用活性。

关于最佳TAM有效诱导剂量与给药途径，目前的相关知识仍很有限，需要继续探索与积累。也建议研究者根据实际具体情况，筛选出适合研究计划的最佳剂量与途径。

（2）TAM诱导毒性

目前已经明确，高剂量腹腔给药TAM，有长期毒性作用，可增加小鼠发病及死亡率。比如，广泛诱导性R26CreERT2小鼠，如果使用高浓度TAM（175 mg/kg, 口腔连续5天）诱导，小鼠出现胸腺萎缩、严重贫血、以及造血细胞异常染色体重排等造血系统相关毒性反应。

也有研究发现，心肌特异性诱导表达的MerCreMer (MCM) 转基因小鼠，经中高剂量TAM（60～90 ug/g, 腹腔连续3～5天）处理后，~60-80%的MCM小鼠出现心脏纤维化，且伴有促炎症细胞因子表达的增加,  最终导致心脏功能衰竭及小鼠死亡。但减少TAM诱导使用剂量或次数（比如30 ug/g，腹腔连续3天给药），不仅可以实现Cre特异性重组作用的最大化（～84%），且最低程度降低其心脏毒性作用的效果。同时，建议应用TAM处理的MCM小鼠作为实验对照。

进一步分析MCM小鼠CreERT转基因插入位点证实，该MCM转基因插入到小鼠基因组染色体19的C1区域，导致约~20 kb基因组片断缺失，该片断包含A1cf基因外显子1及部分内含子1区域。

关于TAM诱导MCM小鼠心脏毒性的可能原因，相关研究认为，TAM诱导的心脏纤维化及心脏衰竭，不是由于MCM的随机插入位点及TAM使用剂量本身的高低引起的，而是因为中高剂量TAM诱导作用，使Cre表达相应增加，从而引起可能的Cre与cloxP隐秘位点的非特异性重组切割有关。因为，（1）不同年龄的MCM小鼠本身未见心脏纤维化现象；（2）同样高剂量TAM诱导野生B6小鼠，未见小鼠心脏纤维化改变；（3）高剂量TAM可引起MCM小鼠体内心肌细胞程序性死亡增加，且可能与DNA破坏激活及p53基因稳定性下降有关；（4）体外原代细胞证实，高表达Cre重组酶，能直接引起细胞的程序性死亡。

有研究对不同策略构建（随机插入和定点敲入）的两种诱导性CD4-CreERT2小鼠品系比较分析，通过将其分别与纯合Rosa26-loxP-stop-loxP-YFP报告小鼠进行交配，TAM诱导后，观察体内T滤泡辅助细胞（Tfh) 动态适合反应，并用不完全蛋白偶联的NP-KLH抗原免疫小鼠，以诱发辅助性Tfh细胞的分化。结果发现，高表达CD4-CreERT2随机插入转基因小鼠，可降低了辅助性Tfh细胞分化数量，干扰了细胞的存活。而低表达CreERT2的定点敲入小鼠， 则能避免因Cre表达过高造成的细胞损失作用，且仍能有效发挥其淋巴细胞特异性重组效率。

前面介绍的TAM诱导的毒性作用研究报道，多与高剂量TAM使用及高表达Cre作用相关。但最近有研究表明，低剂量TAM（20 mg/kg）诱导也会影响小鼠骨形成。研究者采用不同剂量TAM（0、20、40和200 mg/kg，腹腔连续4天）诱导4周龄野生B6小鼠，结果表明，20 mg/kg剂量TAM诱导，即可引起小鼠股骨体积比（骨体积/总体积）增加153%。因此提示，即使应用非常低剂量的TAM诱导，在实际CreERT骨特异性靶基因敲除/表达的研究中，也需要考虑TAM诱导可能影响到小鼠骨小梁和皮质骨的形成过程。

七、Cre-loxP位点特异性重组系统应用中的思考与建议

• Cre小鼠模型构建策略与方法不同，直接会影响到Cre-loxP重组系统作用的特异性及其潜在风险。

从起初传统随机插入研制技术构建的Cre小鼠品系，发现该技术方法自身存在许多不利因素开始，研究者们一直在不断探索研制更加合理的构建策略与方法。

采用BAC介导的转基因技术目的，是为了提升Cre表达的准确特异性。因为BAC克隆更可能包含内源基因的所有调控元件相关序列。但是，某些基因表达调控的远端顺式调控元件或反式调控元件，有可能并不存在或包含于所选择的BAC克隆载体中，从而导致Cre表达无法真正反映内源细胞类型或组织特异性。

最终，采取将Cre基因直接敲入到内源基因位点的策略，成为目前研制Cre小鼠模型的首选。一般认为，为了更加准确复制内源基因的表达特征，可选择通过取代内源基因编码序列的方式（比如CD19-Cre）； 然而，该定点敲入/敲除策略，有可能会影响/破坏内源基因表达。如果该基因为杂合缺失有表型，获得的杂合敲入Cre小鼠，可能会显示一定的表型。即使是杂合缺失无表型基因，单等位基因的破坏，在实际应用中，也建议避免使用纯合Cre小鼠。比如，CD19-Cre敲入/敲除小鼠模型，作为B细胞特异性Cre小鼠，虽然纯合小鼠无任何可见的表型，但由于Cre基因的敲入，使该小鼠缺乏B细胞B-1亚型，表现为血清IgM减少，对T细胞依赖抗原反应能力严重受损，无法形成供B细胞增殖与生长的脾脏生发中心。因此，如果应用纯合CD19-Cre小鼠，开展相关靶基因B细胞特异性敲除研究，自然很难以获得正确的实验结果。

如果为了避免Cre定点敲入基因5‘端，可能引起的不良反应，建议选择将其敲入到内源基因编码区域外的3' 端非翻译区域（UTR）的方式 。然而，该定点敲入的构建策略，也存在一定的限制。由于多数基因转录后的调控过程多发生在其3’UTR区域，因此，在该区域的内源基因mRNA末端，添加相关附加基因序列的改变，存在潜在影响内源基因表达水平及其特征的可能性。

所以，由于不同构建策略方法存在的局限性，有可能产生Cre潜在毒性或干扰相应内源靶基因的表达，导致Cre-loxP重组系统的非特异性生物学效应。为了避免实验研究中，出现对研究结果的错误解释，考虑用Cre小鼠，作为实验对照是有必要的。

2. Cre表达特异性及效率等特征可能与其实际介导的重组切割活性不一致。 

报告小鼠已成为验证确定Cre活性与组织特异性等特征的非常有用工具。该种报告小鼠在其报告基因（如lacZ 或荧光蛋白）前插入两端都携带有loxP位点的终止序列，且这些报告系统多构建在特定所谓“安全”位点（比如最为常用的Rosa26位点）。

有研究发现，科学家们可以通过报告小鼠的验证，获得非常完美的所谓Cre小鼠品系，而在实际应用中却发现，Cre-loxP重组系统的特异性靶基因作用，却远不能满足研究期望目标，表现为该Cre小鼠特异性靶基因切割活性非常不理想或是过分夸张。可能的原因解释之一，与Rosa26位点本身相对松散的染色质结构特性，从而增加了其与Cre蛋白结合敏感性等有关。另外，也有研究表明，某些R26R报告小鼠本身，会出现不依赖Cre重组作用的荧光泄露表达现象，比如，R26R-LSL-Green和R26R-LSL-tdTomato报告小鼠。

其实Cre重组切割活性效率差异，不仅表现在Rosa26位点与实际靶基因位点之间，也表现在不同靶基因之间。提示，由Cre-loxP重组系统介导的切割作用的所谓“敏感性”或效率方面，在每个不同的靶基因作用位点上，都可能表现其独特性质与特征。比如，某Cre小鼠品系可能对某个靶基因位点的切割效率只有10%，但却可对另外靶基因位点，达短100% 重组切割作用。

所以，实际应用中需要注意的是，虽然报告小鼠能提供Cre表达作用的某些特征，但该小鼠对实际靶基因的特异性重组切割作用效果，必须根据其对某个特定基因的单个细胞水平上的实际作用效果进行评估。

3. 需要在特定的靶细胞/组织中鉴定Cre作用活性，以确保其作用的靶向特异性。

为了避免或降低某些Cre小鼠可能引起的明显非特异性脱靶作用，在应用Cre-loxP重组系统，进行靶基因编辑的实验研究中，需要设计合理的PCR鉴定引物组合，目的在于分析鉴别靶基因重组打靶的不同情况，比如，基因的杂合敲除、纯合敲除、未敲除，以及野生对照等可能的多种情况。

一般情况下，应用小鼠尾巴DNA鉴定策略，进行所谓常规特异性基因型鉴定的时候，都不应该检测到靶基因被敲除的结果，除非该研究就是要特异性敲除皮肤上皮细胞的靶基因。这也是判断Cre小鼠是否具有生殖细胞敲除作用的关键。借助如此简单鉴定方法，能非常快速筛选出那些无非特异性切割作用的Cre小鼠品系，以确保实验研究的有效性与可靠性。而且，也可将靶细胞与对照细胞群，进行有效分离和检测，以明确特异性基因敲除的效率。

判断Cre小鼠是否具有生殖系作用活性的另外一个简单方法，是将双性别的Cre小鼠分别与相应性别的报告基因小鼠交配，获得的阳性后代小鼠（F1），再与野生小鼠交配，分析其后代小鼠（F2）的报告基因表达情况，如果此F2小鼠报告基因的表达较其F1更加明显广泛，提示该Cre小鼠可能具有生殖系作用活性。

在Cre-loxP重组系统实际应用中，如果是以提高Cre重组切割作用效率为目的，可采用先建立将靶基因单等位基因，在生殖细胞中敲除小鼠，再与floxed条件性打靶小鼠繁殖的策略。但必须清楚该策略的局限性，即不适合那些靶基因杂合敲除有表型的情况。另外，也不适合需要敲除两个基因以上的实验研究。

• Cre-loxP重组系统与其他重组系统联合应用，增加细胞谱系示踪研究的特异性及有效性

细胞谱系示踪的研究是借助Cre在特定靶细胞的激活，并通过相应报告基因的表达来显示。最为常见的报告基因为荧光蛋白，其表达的特异性与时空性完全依赖于特定Cre激活重组特性。因此，Cre/CreERT2小鼠与报告基因小鼠结合，常应用于细胞谱系示踪、行为学和镶嵌组织中敲除细胞分布等方面研究。

为了改善细胞谱系示踪准确性及有效性，重要的是如何准确有效标记示踪特定细胞群及其后代中某类特殊细胞。如果报告基因在其他细胞群，发生非特异性表达，或者即使是正确的靶细胞群标记表达，但并非出现于研究所期望时间窗口期，都可能导致错误的实验研究结果。

所谓Cre-loxP和Dre-rox双重组系统 , 即利用Cre和Dre双重组酶识别各自特定loxP 和rox位点，比如，分别构建靶基因（比如基因X和Y）相关的双重组酶小鼠，即X-Dre和Y-CrexERT2两种小鼠模型。而Y-CrexERT2小鼠的构建，则是通过在CreERT2载体中ERT2序列两端分别添加一个rox位点序列，从而构建基因X和Y特异性启动子介导的两种Cre小鼠品系。应用该双重组系统，结合报告基因小鼠模型（比如R26-LSL-tdTomato), 实现特定细胞群谱系示踪过程，满足X-Dre和Y-CrexERT2同时表达阳性的限定范围，使更加精准有效研究特定器官或组织特异性细胞谱系示踪成为可能。

国内中科院周斌课题组应用该双重组系统，成功实现了靶基因在冠状动脉血管内皮细胞（Tie2-Dre和Wt1-CrexERT2），或脑血管内皮细胞（Tie-2和Mfsd2a-CrexERT2）的高效及特异性的基因敲除或过表达研究。

• 新型诱导性DD-cre小鼠模型的建立，成为未来Cre-loxP可诱导重组系统的补充

TAM诱导性Cre-ERT2小鼠应用中的不足，比如，需要多次给药，相对较慢的诱导激活与抑制过程；以及TAM可能与小鼠内源性雌激素受体结合，导致相关副作用等，为进一步改善该系统，以及寻找更加有效诱导方法，具有其现实意义。 最近新型诱导性DD-Cre小鼠模型研制应用成功，也为Cre-loxP可诱导重组系统应用，提供了额外的选择。

DD技术的基本原理，是基于来自人的FKBP12或细菌二氢叶酸还原酶 (ecDHFR) 的突变去稳定域（Destabilizing dormain-DD），与任何感兴趣的蛋白（比如Cre) 融合而建立。而合成的含FKBP12或ecDHFR标记的新型DD-相关蛋白，可导致蛋白酶降解过程。但如此蛋白降解破坏通路，可被抗生素甲氧苄啶（Trimethoprim ，TMP）所阻断。

DD-Cre小鼠模型是将DD域与Cre基因融合，构建成去稳定化Cre重组酶系统 的DD-Cre小鼠，且其重组活性由抗生素TMP诱导调控，即DD-Cre激活重组作用为TMP依赖，从而实现体内Cre-loxP重组系统的位点特异性可诱导的靶基因编辑作用。

TMP诱导物价格便宜、无毒性、诱导快速、可通过胎盘及血脑屏障，且在哺乳动物体内无内源靶点存在等优势，使TMP成为稳定DD标记蛋白的理想诱导物。 因此，体内应用TMP诱发蛋白稳定作用，有利于实验动物诱导剂快速传递，发挥其在神经系统等周围组织的高效扩散效应。

有研究借助R26-CAG-tdTomato或R26 Ai9-tdTomato报告小鼠，应用不同浓度TMP（8～170 ug/g, 每天腹腔注射一次或连续七次) 诱导后24～48小时，其重组切割效果达高峰，且呈现剂量依赖效应。  研究表明，相对于CreERT2系统，TMP在体内诱导效果快，使DD-Cre系统成为具有吸引力与理想的广泛应用于神经遗传研究领域的工具。

当然，如同其他方法一样，DD-Cre技术也可能出现一定程度的Cre 背景活性。且活性作用也会受到某些因素的影响，比如，DD融合蛋白的降解率，稳定性结合配体与合适亚细胞域融合的招募，以及DD表记对融合蛋白功能的干预等。

最后，将Cre-loxP 位点特异性重组系统应用中，Cre小鼠构建策略建议性指导原则及需要考虑的因素概括如下：

（1）. 采用定点敲入基因打靶技术构建新型Cre小鼠品系；

（2）. 如果定点敲入基因位点不是杂合致死基因，建议将Cre定点敲入内源相关基因编码序列区域；

（3）. 如果可能的话，将报告基因也构建到新建立的floxed靶基因打靶小鼠；

（4）. Cre小鼠作为靶基因打靶研究的单独对照，以排除Cre小鼠本身引起的非特异性脱靶重组作用; 

（5）. 如果靶基因不是杂合致死基因，可以先建立杂合生殖细胞基因敲除策略，以提高Cre打靶效率;

（6）. 设计合理的PCR特定鉴定引物组合，便于基因型鉴定分析靶基因敲除、野生和特异性靶基因打靶（flexed）等不同情况；

（7）. 应用半合子或杂合Cre小鼠，以降低其可能引起的毒性及脱靶效应作用；

（8）. 如果有floxed小鼠作为附加实验对照，就更加完美；

（9）. 确定诱导剂TAM实际使用剂量预实验的重要性；

（10）. 了解特定Cre小鼠以前实际应用情况，包括其非特异性脱靶、生殖性重组活性、性别及遗传背景等影响因素；

（11）. 如果需要选择两个，或更多靶基因重组和/或靶基因编辑策略，建议应用突变类型的loxP序列，比如loxN、lox2271或lox511；以及其他类似的Dre-rox位点特异性重组系统等；

（12）. 考虑选择其他诱导调控系统，比如，借助抗生素甲氧苄啶（TMP）诱导的DD-Cre新型可调控系统。

（13）. 条件性Floxed小鼠靶基因2 x loxP间DNA长度、染色体位置、表观遗传修饰、生殖细胞转录易接近程度等也可成为Cre作用效率的影响因素。