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如何构建慢病毒过表达载体?

在进行基因功能研究时,开展“加法”实验是常用的科研思路。构建过表达稳转细胞株可有效实现基因的上调,其中慢病毒转染是最常用的构建方法,可达到长效稳定的调控效果。今天就向大家介绍慢病毒过表达载体的构建。

 

首先,我们要确定目的基因序列,即目的基因的转录本。然后根据实际需求选择合适的慢病毒载体骨架和相应的元件。下面通过一个常规的慢病毒载体骨架来介绍不同元件的特点(图1)。

 

图1. 慢病毒过表达载体

 

启动子:位于基因5’端上游,能活化RNA聚合酶,使其与DNA准确结合并开启转录。在常规的过表达实验中,我们可以考虑一些常用的启动子,如CMV、EF1α和CAG启动子等,这些启动子具有强驱动活性和广谱适用的特性。CMV特别适合肿瘤细胞、肌肉、肝脏等体细胞或者贴壁细胞的基因表达;EF1α启动子特别适合干细胞、原代细胞、造血细胞等的基因表达;而CAG启动子特别适合免疫细胞和体细胞中的基因表达。如果需要保证组织特异性,那么可以灵活使用组织特异性的启动子,更好地驱动目的基因在特定的组织或细胞中表达。如CaMKIIa和hSyn等可以在神经元中特异表达;Afp、Alb和Tbg等可以在肝细胞中特异表达(表1)。

 

组成型

启动子

特点

特异性

启动子

特点

CAG

强,广泛表达,序列较长

CaMKIIa

神经元特异性,高表达

CMV

强,广泛表达,常用

hSyn

神经元特异性,高表达

EF1α

广泛表达

Afp

肝细胞

表1. 慢病毒载体常用启动子(部分)

 

荧光标签与筛选标记:荧光标签用于检测载体的表达效率。常用的荧光标签有GFP、EGFP和mCherry等(表2),可以根据实际的实验情况进行选择。需要注意的是,如果实验中需要Luciferase时则最好不再选择EGFP。将两者放在同一个慢病毒载体时,Luciferase或EGFP有其一不能正常观察到荧光。筛选标记用于筛选去掉无抗性的细胞。通常有真核抗性和原核抗性,真核抗性有Puro、Neo、Hygro、BSD等;而原核抗性有Amp、Kan,用于细菌培养质粒扩增。

荧光蛋白

荧光特点

GFP

绿色荧光

EGFP

增强型,EGFP的6倍

copGFP

EGFP的1.3倍

mNeonGreen

新型黄绿色

mCherry

红色

dTomato

红色

表2. 常用的荧光标签

 

5' LTR与3' LTR:5' LTR与3' LTR之间的序列是整合至宿主基因的,因此是目的基因插入的区域。需要注意的是目的基因不能过长,超过9 Kb会降低慢病毒的滴度。并且基因不建议构建反向表达,反向表达会影响病毒滴度。还需注意的是5' LTR与3' LTR之间建议不加polyA,由于HIV是逆转录病毒,加polyA会影响病毒转录。

 

其他元件:其他的元件的作用主要是提高慢病毒的包装效率、滴度和目的基因的表达效率等。如Ψ提供病毒所需的包装信号;RRE在病毒包装过程中允许病毒RNA通过病毒Rev蛋白的核输出;CPPT增加病毒基因组的核输入,提高载体整合到宿主基因组中的效率,从而提高转导效率;Kozak促进真核生物的翻译起始;WPRE增强病毒RNA在包装细胞中的稳定性,使包装病毒的效价更高;T2a作为连接子,连接上下游两个游两个基因,在翻译后T2a会断裂,断开所连接的两个蛋白;SV40 early pA促进包装过程中的转录终止,提高病毒滴度。

 

选择好符合实验需求的启动子、荧光标签和筛选标记等元件后,下一步则是获取带有酶切位点的目的片段。可以通过直接合成或PCR扩增获得。直接合成法是根据目的基因的序列直接合成;PCR扩增法是提取目的基因高表达样品的RNA,然后以反转录得到的cDNA作为模板,设计相应的引物扩增获得目的片段。

接着便可以将目的片段连接至载体中。酶切带有酶切位点的目的片段与载体骨架,然后通过连接酶将两者连接形成带有目的片段的重组载体。将重组载体转化至感受态细胞中并扩增重组载体,再经过测序确认重组载体构建无误。

最后包装成慢病毒,将重组载体和3个用于病毒包装的辅助质粒共转染至293T细胞中,转染后通过观察荧光确认转染效率,超速离心收集慢病毒所在的上清液并过滤,接着用PEG-NaCl浓缩,通过蔗糖垫纯化慢病毒,最后进行滴度测定和无菌检测等。

 

使用质粒法过表达外源基因具有简便、成本低和实验体系成熟等优点,因此大多数实验室会偏向于使用质粒法。但是对于有特别需求的过表达实验,如难以转染的细胞、需要稳定遗传目的基因和需要极高的转染效率等,那么质粒法则难以满足我们的需求。

 

这时候用慢病毒法往往可以得到更好的实验结果。下面再详细介绍在构建过表达载体时慢病毒法相对于质粒法的优势:

1. 外源基因能稳定整合与表达。质粒法过表达外源基因只能实现瞬时过表达,外源基因会随着宿主细胞的分裂传代而不断丢失。而慢病毒法则是将外源基因整合至宿主的细胞中,因而会随着宿主细胞的分裂传代而稳定遗传。

 

2. 高效的转导效率。由于受到较多因素的影响,质粒法的转染效率往往不高。这些因素如细胞类型、电转参数、质粒大小和质粒大小等。而慢病毒法则可以包装出滴度极高的慢病毒,并且慢病毒的VSV-G蛋白具有广泛的亲和性,几乎能感染所有的哺乳动物细胞,因此慢病毒法有极高的感染效率与转导效率。

 

3. 基因拷贝数相对均一。由于质粒法转染获得细胞的拷贝数往往是不均一的,会出现部分细胞拷贝数高,部分细胞拷贝数低甚至没有,这就造成了目的基因在不同细胞中的表达量存在差异,使得各个细胞的遗传表型存在差异。而慢病毒转导所获得的细胞的基因拷贝数相对均一。

 

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