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Cdc42条件性敲除小鼠【每周一鼠】

Cdc42条件性敲除小鼠

赛业生物《每周一鼠》,每周五更新,为大家讲解一个小鼠模型的故事,希望对大家了解不同的小鼠模型有所帮助。今天和大家见面的是Cdc42基因敲除小鼠。

 

Cdc42基因简介

该基因编码的蛋白质是Rho亚家族的一种小GTP酶,它调节控制多种细胞功能的信号通路,包括细胞形态、迁移、内吞作用和细胞周期进程。该种蛋白质可以通过直接与神经Wiskott-Aldrich综合征蛋白(N-WASP)结合来调节肌动蛋白聚合,从而激活Arp2/3复合物。其相关途径为DNA损伤反应(仅依赖于ATM)和信号素相互作用。

Cdc42条件性敲除小鼠

图1.Cdc42蛋白结构

 

CDC42相关疾病介绍

与CDC42相关的疾病有心脏、胼胝体发育不全、眼部和生殖器综合征。

 

研究表明,心血管疾病是全球第一大致死性疾病。该病包括心脏病、冠状动脉疾病、脑血管疾病与主动脉疾病等,多种病因会导致此病的发生,如动脉粥样硬化、高血压、高血脂、糖尿病、吸烟、压力、久坐不动及酗酒等。临床多表现为心悸、胸痛、头痛、呕吐、偏瘫等,严重影响生活质量[1]。不同类型的心血管疾病,治疗方法不一,其中,心肌梗死的治疗药物有阿司匹林、P2Y12抑制剂、抗凝剂、β-受体阻滞剂、硝酸盐和他汀类药物等,降血压药物有氢氯噻嗪、螺内酯、可乐定、利血平等[2]

 

肢体发育的相关研究显示,脊椎动物的骨骼是由肢芽发育而来,肢芽是由外胚层未分化的间充质细胞组成。骨骼发育过程中,间充质细胞被募集形成聚集体,进而分化成结缔组织,包括肌腱、韧带和软骨细胞,肢体发育异常尚无有效治疗方法[3]

 

Cdc42条件性敲除小鼠

心血管异常表型

Jin Y等人在2号外显子插入loxP-Neo-loxP元件,再通过与Tie2-Cre小鼠杂交,以产生敲除2号外显子序列的血管内皮细胞特异性敲除小鼠[4]。研究发现,Tie2-Cre小鼠与Cdc42flox/flox交配产生的后代CEKO(血管内皮细胞敲除)小鼠,CEKO胚胎在E9.5时,超过一半的胚胎表现为生长迟缓,心脏循环延迟,心室透明,卵黄囊的血管几乎完全消失,无明显血管形成。组织学分析发现这类小鼠的卵黄囊缺乏明显的血管,其胚胎在E10.5后死亡(图 2)。

Cdc42条件性敲除小鼠

图2. 血管内皮细胞中Cdc42的缺失导致卵黄囊血管发生缺陷

图注:(A~D):E8.5 对照 (A) 和CEKO (B) 胚胎的总体检查显示出相似的形态。E9.5 对照 (C) 和 CEKO (D) 胚胎的侧视图显示 CEKO 胚胎的身体较小。(E 、F)对照 E9.5 卵黄囊呈现高度组织化的脉管系统(箭头)(E),但在CEKO胚胎(F)的卵黄囊中只有血管是明显的。(G、H) 用PECAM-1对对照(G)和CEKO (H)胚胎的卵黄囊进行整体染色。(I、J)来自对照(I)和CEKO (J)胚胎的卵黄囊苏木精和伊红染色切片。箭头表示卵黄囊中的血管。条形,25 μm。

 

PECAM-1免疫荧光染色实验显示,与对照胚胎相比,CEKO胚胎中无法形成良好的体间血管;同时,对照组胚胎的心脏中可检测到新形成的血管,而CEKO胚胎未检测到(图 3)[4]

Cdc42条件性敲除小鼠

图3. Cdc42的失活损害了躯干区域和心脏的血管形成

图注:用PECAM-1对E9.5对照(A和C)和CEKO(B和D)胚胎进行整体染色。箭头表示对照胚胎的躯干(A)和心脏(C)中的血管。在CEKO 胚胎的躯干(B)和心脏(D)中未检测到明显的血管。条形,25 μm。

 

Li J等人将Cdc42flox/flox小鼠与MLC-2a Cre小鼠杂交产生心肌细胞特异性敲除小鼠CCKO(心肌细胞敲除)[5]。实验结果表明,与对照组相比,CCKO中Cdc42的表达水平显著降低。虽然部分存活的小鼠可发育到成年,但在3个月内死亡,且存活的小鼠心脏发育迟缓,心室小,右心房扩大。E14.5 CCKO胚胎心室小且两心室间有深的尖裂(图 4)[5]

Cdc42条件性敲除小鼠

图4. 胚胎心肌细胞中Cdc42的缺失会损害心脏形成并伴有室间隔缺损

图注:A:用Cdc42和总Erk (T-Erk)抗体通过蛋白质印迹分析从E14.5胚胎心脏制备的组织裂解物。B:对照和CCKO心脏中Cdc42表达水平的定量分析。C:通过蛋白质印迹检查Rac1和RhoA表达水平,并将GAPDH作为对照。(D~G ):3 个月大( D和E)和E14.5(F和G)对照(D和F)的大体检查和CCKO(E和G)的心。与对照组(D)相比,存活的3个月大CCKO小鼠心脏的心室较小(红色箭头)和右心房扩大(蓝色箭头)(E)。E14.5 胚胎心脏的整体检查显示心室较小(红色箭头)和 CCKO 中的深根尖裂(白色箭头)(G)。H&E 染色显示 E14.5 CCKO 胚胎心脏 ( I )中的室间隔缺损(红色箭头),但在对照组 ( H ) 中没有。比例尺:250  µm。

 

肢体发育异常表型

Aizawa R等人将Cdc42flox/flox小鼠与Prx1-Cre小鼠交配产生枝芽间充质特异性敲除小鼠[3]。实验发现,与新生Cdc42flox/flox小鼠相比,Cdc42flox/flox;Prx1-Cre新生小鼠四肢与身体更为短小,头盖骨(额骨、顶骨)有异常钙化,腭架伸长失败,胸骨分叉,剑突畸形或缺失(图 5)[3]

Cdc42条件性敲除小鼠

图5. Cdc42条件性敲除小鼠的骨骼表型

图注:(A):出生后第0天(P0)的总体形态。Cdc42fl/fl ;Prx1-Cre新生儿表现出四肢和身体的缩短。(B):P18的总体形态。Cdc42fl/fl;Prx1-Cre小鼠表现出四肢和身体的缩短同窝仔。全身的代表性X射线照片(下图)。(C):阿尔新蓝和茜素红染色的骨骼制剂(上图),以及在P0获得的头骨背侧视图的微型计算机断层扫描图像(下图)。在Cdc42fl/fl;Prx1-Cre小鼠头骨中观察到延迟融合。(D) :Cdc42fl/fl;Prx1-Cre小鼠在P0处有腭裂(黑色箭头)。(E):P0小鼠的苏木精和伊红染色的横向组织切片。(F):P0小鼠扁平安装解剖肋骨的阿尔新蓝和茜素红染色骨骼制剂。在Cdc42fl/fl;Prx1-Cre小鼠中观察到剑突过程的中断(黑色箭头)。(G):P0小鼠前肢(FL)和后肢(HL)的阿尔新蓝和茜素红染色骨骼制品。(H):P0小鼠FL和HL的大体观察和微计算机断层扫描图像。第2和第3掌骨融合见于FL(f中的红色箭头)。(I) :P18小鼠FL和HL的大体观察和微计算机断层扫描图像。Cdc42fl/fl;Prx1-Cre可见严重畸形和发育不全(e双红色星号)。在Cdc42fl/fl;Prx1-Cre HL中观察到软组织并指(g中的单个红色星号)。

 

总结

小鼠Cdc42功能丧失导致的心血管疾病和肢体发育异常具有潜在的临床意义,对这一基因的深入研究有助于进一步探讨心血管疾病与肢体发育异常发病的机制,同时亦可用于此类疾病治疗新方法的研究。

Cdc42条件性敲除小鼠

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Cdc42条件性敲除小鼠

参考文献:

1. Martin-Ventura JL, Roncal C, Orbe J, Blanco-Colio LM. Role of Extracellular Vesicles as Potential Diagnostic and/or Therapeutic Biomarkers in Chronic Cardiovascular Diseases. Front Cell Dev Biol. 2022 Jan 26;10:813885. doi: 10.3389/fcell.2022.813885. PMID: 35155428; PMCID: PMC8827403.

2. Merlo AC, Bona RD, Ameri P, Porto I. Type 2 myocardial infarction: a diagnostic and therapeutic challenge in contemporary cardiology. Intern Emerg Med. 2022 Feb 14:1–8. doi: 10.1007/s11739-021-02920-8. Epub ahead of print. PMID: 35157215; PMCID: PMC8853072.

3. Jin Y, Liu Y, Lin Q, Li J, Druso JE, Antonyak MA, Meininger CJ, Zhang SL, Dostal DE, Guan JL, Cerione RA, Peng X. Deletion of Cdc42 enhances ADAM17-mediated vascular endothelial growth factor receptor 2 shedding and impairs vascular endothelial cell survival and vasculogenesis. Mol Cell Biol. 2013 Nov;33(21):4181-97. doi: 10.1128/MCB.00650-13. Epub 2013 Aug 26. PMID: 23979594; PMCID: PMC3811890.

4. Li J, Liu Y, Jin Y, Wang R, Wang J, Lu S, VanBuren V, Dostal DE, Zhang SL, Peng X. Essential role of Cdc42 in cardiomyocyte proliferation and cell-cell adhesion during heart development. Dev Biol. 2017 Jan 15;421(2):271-283. doi: 10.1016/j.ydbio.2016.12.012. Epub 2016 Dec 14. PMID: 27986432.

5. Aizawa R, Yamada A, Suzuki D, Iimura T, Kassai H, Harada T, Tsukasaki M, Yamamoto G, Tachikawa T, Nakao K, Yamamoto M, Yamaguchi A, Aiba A, Kamijo R. Cdc42 is required for chondrogenesis and interdigital programmed cell death during limb development. Mech Dev. 2012 Mar-Jun;129(1-4):38-50. doi: 10.1016/j.mod.2012.02.002. Epub 2012 Feb 25. PMID: 22387309.

 

关于赛业

 

赛业生物成立于2006年,是一家借助AI赋能药物研发的创新性CRO公司。目前员工人数超900名,总规模超40000平方米,在中国广州、苏州、固安设立有全资子公司,在成都、北京、上海、武汉、长沙等地设有办事处,在美国Santa Clara和日本东京设有分公司。过去十余年,赛业生物依托于品系丰富的基因编辑小鼠资源库、高效智能化的大小鼠定制平台、规模化的大小鼠快速繁育平台以及严格质控的无菌鼠技术服务平台,在模式动物基因编辑技术方面走在行业前沿,同时也积累了大量的生物信息及基因编辑方面的数据。结合在人工智能领域的深度探索,赛业生物可为从事基因治疗和细胞治疗的研究者提供一站式整体解决方案,包括AI靶点筛选与功能研究、动物模型构建、治疗性载体设计与优化、病毒包装以及药理药效学研究等全流程服务,助力提高基因治疗和细胞治疗基础研究的临床转化效率。

 

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