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从GPRC5D看CAR-T靶点的发现与研究

CAR-T靶点发现与研究

今年2月,驯鹿医疗在Clinicaltrails.org注册了以GPRC5D为靶点的CAR-T临床一期研究,旨在初步观察用于复发性/难治性多发性骨髓瘤或浆细胞白血病患者的疗效。

 

目前在Clinicaltrails.org以及中国临床试验注册中心(ChiCTR)注册的GPRC5D-CAR-T临床研究共有5项,我国有3项,分别由驯鹿医疗、原启生物、徐州医科大学附属医院发起。其余两项分别由纪念斯隆-凯特琳癌症中心、强生发起,其中,强生GPRC5D/CD3双抗研究已经进入到临床二期阶段[1][2]。

 

本文结合纪念斯隆-凯特琳癌症中心于2019年发表在Science Translational Medicine的文献GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells来简要讲述CAR-T靶点的发现过程[3]。

 

一、背景介绍

1CAR-T研究中的靶点分类

 

CAR-T细胞通过特异性识别肿瘤细胞表面的抗原,对肿瘤细胞进行靶向杀伤作用,因此靶点抗原的选择对CAR-T对研究极为重要。

▷肿瘤特异性抗原:在正常组织中不表达,仅在肿瘤细胞表面特异性表达,是最理想的抗原靶点。然而,这种理想抗原数量稀有。

▷肿瘤相关抗原:在正常组织中低表达,在肿瘤细胞表面过度表达,是目前研究最多的靶点。

 

2G蛋白偶联受体C5家族亚型D

 

G蛋白偶联受体C5家族亚型D(GPRC5D)是一种孤儿受体,其配体和信号传导机制尚未确定,结构上属于7次跨膜蛋白。纪念斯隆-凯特琳癌症中心的研究证明了GPRC5D在多发性骨髓瘤(MM)细胞上表达,除此之外,GPRC5D也在毛囊上表达,由于毛囊属于免疫豁免部位,使GPRC5D成为潜在靶点[3]。

CAR-T靶点发现与研究

Figure 1 GPRC5D结构示意图[4]。

注:孤儿受体(Orphan Receptor)是指与其它已确认的受体结构明显相似,但其内源配体还未发现的受体。

 

3多发性骨髓瘤

 

多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞病,其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞。MM发病率估计为2~3/10万,男女比例为1.6:1,大多患者年龄大于40岁。其特征为骨髓浆细胞异常增生伴有单克隆免疫球蛋白或轻链(M蛋白)过度生成,极少数患者可以是不产生M蛋白的未分泌型MM。多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害。由于正常免疫球蛋白的生成受抑,因此容易出现各种细菌性感染。

CAR-T靶点发现与研究

Figure 2 多发性骨髓瘤示意图[5]。

 

二、CAR-T靶点的发现过程

1GPRC5D在MM细胞上特异性表达

 

为了验证GPRC5D的特异性表达,纪念斯隆-凯特琳癌症中心评估了1000种以上的恶性肿瘤细胞系,结果表明GPRC5D在多发性骨髓瘤细胞上表达,而在其他肿瘤细胞系中无实质性的表达。

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Figure 3 恶性细胞系中GPRC5D的mRNA 表达( n = 1036)。DLBCL:弥漫性大 B 细胞淋巴瘤;CML:慢性粒细胞白血病;ALL:急性淋巴细胞白血病;AML:急性髓性白血病;NSC:非小细胞肺癌。[3]

 

此外,在人体组织的评估中,GPRC5D 在除皮肤和骨髓样本以外的任何正常组织中均为低表达,在皮肤中表达不定;而在骨髓样本中,原发性恶性浆细胞和正常浆细胞的GPRC5D mRNA表达量比外周血B细胞中mRNA的表达量分别高出 1000 倍和 500 倍。

CAR-T靶点发现与研究

Figure 4 正常组织中GPRC5D的mRNA 表达。[3]

 

2GPRC5D表达与BCMA表达是独立的

 

使用BCMA作为多发性骨髓瘤的靶点已经成熟,2021年3月,BMS/蓝鸟生物共同研发,以BCMA为靶点的Abecma由FDA批准上市。因此,验证GPRC5D的表达与BCMA无关十分重要。纪念斯隆-凯特琳癌症中心使用免疫组化(IHC)验证分析了83个多发性骨髓瘤患者的骨髓样本,通过对比每个样本中GPRC5D和BCMA表达的比例,得出结论GPRC5D 表达与 BCMA 表达无关(R2 = 0.156)。

CAR-T靶点发现与研究

 

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Figure 5 A. 原发性骨髓瘤骨髓 CD138、BCMA 和 GPRC5D 的代表性免疫染色。D. CD138+细胞上 BCMA 和 GPRC5D 表达的相关性;R2 = 0.156。[3]

 

3scFv & CAR分子设计

 

噬菌体展示技术(Phage Display)将目标基因插入噬菌体衣壳壳蛋白的基因中,使目标基因表达并与噬菌体颗粒的衣壳蛋白融合,在基因型和表型之间建立联系。然后通过组装数百万个转基因噬菌体建立噬菌体展示库,用于大规模研究分子相互作用,如蛋白质-蛋白质、蛋白质-肽和蛋白质-DNA相互作用,并选择对特定靶标亲和力最高的分子。

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Figure 6 丝状噬菌体M13结构示意图[6]。目标基因根据序列长短通常表达于pⅢ或pⅧ。

 

纪念斯隆-凯特琳癌症中心使用噬菌体展示文库鉴定了 7 个 GPRC5D 特异性(与MM细胞特异性结合最高,但不与GPRC5D阴性细胞结合)单链可变片段 (scFv),并构建出42 种不同的CAR分子(每个scFv分别构建长、中、短3种铰链区(Hinge),以及VH/VL和VL/VH两种不同的方向,即每个scFv构建6种CAR分子),用于进一步的特异性筛选。结果表明,含有GPRC5D (109) 、具有VL/VH方向、拥有长铰链区的 CAR分子,对抗原暴露最敏感。

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Figure 7 D. 使用7种不同的scFv构建CAR分子的抗原依赖性信号传导(蓝色)与非抗原依赖性信号传导(橙色)。E. 含有GPRC5D (109) 、具有VL/VH方向、拥有长铰链区的 CAR分子对抗原最敏感,而且非抗原依赖性信号传导最弱。[3]

 

4下游验证试验

经由上面几轮鉴定,纪念斯隆-凯特琳癌症中心筛选出最佳CAR的分子结构,并构建CAR-T细胞,进行一系列的体内外药效分析、脱靶效应分析等,本文不再详细展开。

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Figure 8 构建3种靶向CD19、BCMA、GPRC5D的CAR-T细胞,与多发性骨髓瘤细胞共孵育的体外杀伤结果,可见BCMA CAR-T和GPRC5D CAR-T对多发性骨髓瘤细胞的杀伤效果基本一致。[3]

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Figure 9 构建靶向CD19、GPRC5D的CAR-T细胞,在多发性骨髓瘤小鼠模型中的活体成像监测结果。[3]

 

纪念斯隆-凯特琳癌症中心最终得出结论,在体外活性验证中,靶向GPRC5D的CAR-T细胞与靶向BCMA的CAR-T细胞表现出一致的杀伤能力;体内活性验证中,靶向GPRC5D的CAR-T细胞与靶向BCMA的CAR-T细胞对于清除肿瘤和延长生存期的表现一致。因此,GPRC5D是多发性骨髓瘤免疫治疗的另一有效靶点,并且在体内 BCMA 抗原逃逸复发模型中,靶向GPRC5D的CAR-T细胞依然具有抗肿瘤活性。

 

三、总结

本文通过对纪念斯隆-凯特琳癌症中心对GPRC5D研究的介绍,给大家讲解了CAR-T靶点发现的一般思路:

  1. 验证靶点的特异性,满足在靶细胞高表达,正常组织低表达;

  2. 筛选高亲和力的scFv;

  3. 由筛选出的scFv设计CAR分子结构,进一步分析和鉴定;

  4. 构建CAR-T细胞,进行体内外药效评估。

 

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CAR-T靶点发现与研究

 

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参考文献:

[1]https://clinicaltrials.gov/

[2]http://www.chictr.org.cn/

[3]Smith, E. L., Harrington, K., Staehr, M., Masakayan, R., Jones, J., Long, T. J., ... & Brentjens, R. J. (2019). GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Science translational medicine, 11(485), eaau7746.

[4]https://www.creative-biolabs.com/

[5]https://www.teresewinslow.com/

[6]https://www.proteogenix.science/

 

关于赛业

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