从GPRC5D看CAR-T靶点的发现与研究

今年2月，驯鹿医疗在Clinicaltrails.org注册了以GPRC5D为靶点的CAR-T临床一期研究，旨在初步观察用于复发性/难治性多发性骨髓瘤或浆细胞白血病患者的疗效。

目前在Clinicaltrails.org以及中国临床试验注册中心（ChiCTR）注册的GPRC5D-CAR-T临床研究共有5项，我国有3项，分别由驯鹿医疗、原启生物、徐州医科大学附属医院发起。其余两项分别由纪念斯隆-凯特琳癌症中心、强生发起，其中，强生GPRC5D/CD3双抗研究已经进入到临床二期阶段[1][2]。

本文结合纪念斯隆-凯特琳癌症中心于2019年发表在Science Translational Medicine的文献GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells来简要讲述CAR-T靶点的发现过程[3]。

CAR-T细胞通过特异性识别肿瘤细胞表面的抗原，对肿瘤细胞进行靶向杀伤作用，因此靶点抗原的选择对CAR-T对研究极为重要。

G蛋白偶联受体C5家族亚型D（GPRC5D）是一种孤儿受体，其配体和信号传导机制尚未确定，结构上属于7次跨膜蛋白。纪念斯隆-凯特琳癌症中心的研究证明了GPRC5D在多发性骨髓瘤（MM）细胞上表达，除此之外，GPRC5D也在毛囊上表达，由于毛囊属于免疫豁免部位，使GPRC5D成为潜在靶点[3]。

Figure 1 GPRC5D结构示意图[4]。

注：孤儿受体（Orphan Receptor）是指与其它已确认的受体结构明显相似，但其内源配体还未发现的受体。

多发性骨髓瘤（MM）是一种恶性浆细胞病，其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞。MM发病率估计为2～3/10万，男女比例为1.6：1，大多患者年龄大于40岁。其特征为骨髓浆细胞异常增生伴有单克隆免疫球蛋白或轻链（M蛋白）过度生成，极少数患者可以是不产生M蛋白的未分泌型MM。多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害。由于正常免疫球蛋白的生成受抑，因此容易出现各种细菌性感染。

Figure 2 多发性骨髓瘤示意图[5]。

为了验证GPRC5D的特异性表达，纪念斯隆-凯特琳癌症中心评估了1000种以上的恶性肿瘤细胞系，结果表明GPRC5D在多发性骨髓瘤细胞上表达，而在其他肿瘤细胞系中无实质性的表达。

Figure 3 恶性细胞系中GPRC5D的mRNA 表达（ n = 1036）。DLBCL：弥漫性大 B 细胞淋巴瘤；CML：慢性粒细胞白血病；ALL：急性淋巴细胞白血病；AML：急性髓性白血病；NSC：非小细胞肺癌。[3]

此外，在人体组织的评估中，GPRC5D 在除皮肤和骨髓样本以外的任何正常组织中均为低表达，在皮肤中表达不定；而在骨髓样本中，原发性恶性浆细胞和正常浆细胞的GPRC5D mRNA表达量比外周血B细胞中mRNA的表达量分别高出 1000 倍和 500 倍。

Figure 4 正常组织中GPRC5D的mRNA 表达。[3]

使用BCMA作为多发性骨髓瘤的靶点已经成熟，2021年3月，BMS/蓝鸟生物共同研发，以BCMA为靶点的Abecma由FDA批准上市。因此，验证GPRC5D的表达与BCMA无关十分重要。纪念斯隆-凯特琳癌症中心使用免疫组化（IHC）验证分析了83个多发性骨髓瘤患者的骨髓样本，通过对比每个样本中GPRC5D和BCMA表达的比例，得出结论GPRC5D 表达与 BCMA 表达无关（R2 = 0.156）。

Figure 5 A. 原发性骨髓瘤骨髓 CD138、BCMA 和 GPRC5D 的代表性免疫染色。D. CD138⁺细胞上 BCMA 和 GPRC5D 表达的相关性；R² = 0.156。[3]

噬菌体展示技术（Phage Display）将目标基因插入噬菌体衣壳壳蛋白的基因中，使目标基因表达并与噬菌体颗粒的衣壳蛋白融合，在基因型和表型之间建立联系。然后通过组装数百万个转基因噬菌体建立噬菌体展示库，用于大规模研究分子相互作用，如蛋白质-蛋白质、蛋白质-肽和蛋白质-DNA相互作用，并选择对特定靶标亲和力最高的分子。

Figure 6 丝状噬菌体M13结构示意图[6]。目标基因根据序列长短通常表达于pⅢ或pⅧ。

纪念斯隆-凯特琳癌症中心使用噬菌体展示文库鉴定了 7 个 GPRC5D 特异性（与MM细胞特异性结合最高，但不与GPRC5D阴性细胞结合）单链可变片段 （scFv），并构建出42 种不同的CAR分子（每个scFv分别构建长、中、短3种铰链区（Hinge），以及V_H/V_L和V_L/V_H两种不同的方向，即每个scFv构建6种CAR分子），用于进一步的特异性筛选。结果表明，含有GPRC5D (109) 、具有V_L/V_H方向、拥有长铰链区的 CAR分子，对抗原暴露最敏感。

Figure 7 D. 使用7种不同的scFv构建CAR分子的抗原依赖性信号传导（蓝色）与非抗原依赖性信号传导（橙色）。E. 含有GPRC5D (109) 、具有V_L/V_H方向、拥有长铰链区的 CAR分子对抗原最敏感，而且非抗原依赖性信号传导最弱。[3]

经由上面几轮鉴定，纪念斯隆-凯特琳癌症中心筛选出最佳CAR的分子结构，并构建CAR-T细胞，进行一系列的体内外药效分析、脱靶效应分析等，本文不再详细展开。

Figure 8 构建3种靶向CD19、BCMA、GPRC5D的CAR-T细胞，与多发性骨髓瘤细胞共孵育的体外杀伤结果，可见BCMA CAR-T和GPRC5D CAR-T对多发性骨髓瘤细胞的杀伤效果基本一致。[3]

Figure 9 构建靶向CD19、GPRC5D的CAR-T细胞，在多发性骨髓瘤小鼠模型中的活体成像监测结果。[3]

纪念斯隆-凯特琳癌症中心最终得出结论，在体外活性验证中，靶向GPRC5D的CAR-T细胞与靶向BCMA的CAR-T细胞表现出一致的杀伤能力；体内活性验证中，靶向GPRC5D的CAR-T细胞与靶向BCMA的CAR-T细胞对于清除肿瘤和延长生存期的表现一致。因此，GPRC5D是多发性骨髓瘤免疫治疗的另一有效靶点，并且在体内 BCMA 抗原逃逸复发模型中，靶向GPRC5D的CAR-T细胞依然具有抗肿瘤活性。

本文通过对纪念斯隆-凯特琳癌症中心对GPRC5D研究的介绍，给大家讲解了CAR-T靶点发现的一般思路：

1. 验证靶点的特异性，满足在靶细胞高表达，正常组织低表达；

2. 筛选高亲和力的scFv；

3. 由筛选出的scFv设计CAR分子结构，进一步分析和鉴定；

4. 构建CAR-T细胞，进行体内外药效评估。

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