一文了解Smad2 基因敲除小鼠【每周一鼠】

Smad2基因

Smad2基因编码的蛋白质属于SMAD蛋白家族，SMAD蛋白是介导多种信号通路的信号转导和转录的调节剂。该蛋白质可通过介导转化生长因子（TGF-β）的信号，来调节多种细胞过程，如细胞增殖、凋亡和分化等。此蛋白质亦可通过与受体激活（SARA）蛋白的SMAD锚的相互作用被招募到TGF-β受体，从而响应TGF-β信号，被TGF-β受体磷酸化。其相关途径有SMAD2/3在癌症中的功能丧失和心血管疾病发病机制中的假设途径。

图1. Smad2 蛋白结构

SMAD2相关疾病介绍

与SMAD2相关的疾病有先天性心脏缺陷、 Loeys-Dietz综合征。

心脑血管疾病是心脏血管与脑血管疾病的总称，主要指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所致的心脏、大脑及全身组织发生缺血与出血的疾病。该病的主要致病因素为血管壁平滑肌细胞非正常代谢。心血管疾病多表现为心悸、气短、端坐呼吸、夜间阵发性呼吸困难、胸骨后的压迫性或紧缩性疼痛、胸闷不适等；脑血管疾病的主要症状为偏瘫、偏身感觉障碍、交叉性感觉障碍、共济失调等。

研究表明，心脑血管疾病是目前全球死亡和残疾的主要病因，每年3.5亿人因此病残疾失去自理能力，严重影响着人类、尤其是老年人^[3]的健康。心脑血管疾病发病机制多种，症状不一，治疗方法亦多种，如：心肌梗死的治疗药物有阿司匹林、P2Y12抑制剂、抗凝剂、β-受体阻滞剂、硝酸盐和他汀类药物等，降血压药物有氢氯噻嗪、螺内酯、可乐定、利血平等^[4]。

Smad2小鼠模型表型介绍

研究人员将lox P位点两侧的PGK-neo-poly (A)盒引入Smad2外显子8的下游，在外显子7上游引入了一个额外的lox P位点。通过与Nes-Cre小鼠杂交敲除7~8号外显子序列，产生中枢神经系统（CNS）敲除小鼠（图2）^[1]。

研究结果表明，Smad2-CNS-KO小鼠的小脑在P14时前后轴受损严重，小脑叶状结构缺陷。在E18.5时，对照组小鼠小脑分为四个主裂和五个主叶，而Smad2-CNS-KO小鼠小脑分为两个主裂和三个主叶。在P5时，Smad2-CNS-KO小鼠小脑缺乏小舌沟（图3）。Smad2-CNS-KO小鼠在整个发育过程中小脑分叶异常^[1]。

图2. Smad2条件性敲除小鼠的产生

图注：A：Smad2条件靶向策略的示意图。将lox P位点两侧的PGK-neo-poly (A)盒引入外显子8的下游。在外显子7上游引入了一个额外的lox P位点。箭头表示同源重组体的选择和Cre介导的外显子7和8缺失。B：Smad2的基因分型-CNS-KO小鼠及其同窝仔。通过使用Lox-3S和Lox-2R引物，从flox等位基因产生了500bp的条带，而从对照等位基因产生了351bp的条带。通过使用Cre正向和反向引物，生成了100 bp的条带。C：Smad2-CNS-KO小鼠Smad2蛋白的消融。在野生型小鼠大脑和小脑中检测到Smad2蛋白质，但在P8的Smad2突变小鼠中未检测到（上图）。上条带检测到Smad2 (58 kDa) 的全长（FL）同种型，下条带检测到缺少外显子3的Smad2的短同种型。GAPDH 用作内部对照（下图）。

图 3. 小脑发育异常

图注：A、B：在P14对Smad2-CNS-KO和对照小鼠大脑的总体观察。与对照组相比，Smad2-CNS-KO小鼠的小脑明显更小，暴露的丘脑更多。C~L：在E16.5、E18.5、P5、P14 和P18时通过内侧对照和Smad2-CNS-KO大脑对矢状切片进行H&E染色。在E16.5时，我们发现Smad2-CNS-KO和对照小鼠中存在相似的细胞群。到E18.5，四个主要裂隙和五个主叶在对照小鼠中很明显，并且在突变体中观察到叶化减少。箭头表示在Smad2-CNS-KO小鼠中不出现的裂隙形成小叶（实心箭头）或亚小叶（空白箭头）。箭头表明，与对照小鼠相比， Smad2-CNS-KO 小鼠的第十个小叶似乎很小，并且存在额外的特定小叶。比例尺，200μm。

研究发现，Smad2^fl/fl与Wnt1-Cre杂交可产生神经嵴细胞（NCC）特异性敲除小鼠。结果表明，在胚胎第11.5天时，Smad2 NCC特异性缺失抑制了主动脉弓动脉 III、IV 和 VI 中的血管平滑肌细胞（VSMC）分化，Smad2的缺失降低了主动脉弓中 α-肌动蛋白（α-SMA）的表达（图4）。数据表明，Smad2对VSMC的分化意义中重大^[2]。

图4. 血管异常表型

图注：A：NCC中的Smad2缺失阻断了主动脉弓动脉中VSMC标记基因的表达。野生型（Smad2^+/+，左）或Smad2 NCC特异性缺失胚胎第 11.5 天小鼠胚胎（Smad2^-/-，右）的矢状切片用苏木精和伊红（H&E）染色或用平滑肌α-免疫染色如图所示，肌动蛋白（α-SMA）或Smad2 抗体。背主动脉（DA）和主动脉弓动脉 III、IV和VI中的 α-SMA 染色分别用箭头表示。NCC中的Smad2缺失阻断了主动脉弓动脉中的α-SMA表达，但不阻断背主动脉 （×40）。B：野生型或Smad2 NCC缺失小鼠主动脉和第四主动脉弓动脉（AAA）中α-SMA表达的更高放大倍数。α-SMA在AAA中被显着阻断，NCC中Smad2 缺失，但在主动脉中没有（×400）。C：NCC中Smad2的缺失不会改变NCC迁移。用 X-gal对携带R26R报告基因的胚胎第11.5天野生型（上）和Smad2 NCC特异性缺失（下）小鼠胚胎进行染色。然后将胚胎石蜡包埋并切片，以观察DA和主动脉弓动脉 III、IV和VI中的LacZ染色，如图所示（右）。Smad2删除不影响NCC迁移到主动脉弓动脉。

总结

小鼠SMAD2功能丧失相关的心脑血管疾病具有潜在的临床意义，对这一基因的深入研究有助于进一步探讨心脑血管疾病发病的机制，同时亦可用于此类疾病治疗新方法的研究。

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