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一文了解Smad2 基因敲除小鼠【每周一鼠】

Smad2 基因敲除小鼠

赛业生物《每周一鼠》,每周五更新,为大家讲解一个小鼠模型的故事,希望对大家了解不同的小鼠模型有所帮助。今天和大家见面的是Smad2基因敲除小鼠。

 

Smad2基因

Smad2基因编码的蛋白质属于SMAD蛋白家族,SMAD蛋白是介导多种信号通路的信号转导和转录的调节剂。该蛋白质可通过介导转化生长因子(TGF-β)的信号,来调节多种细胞过程,如细胞增殖、凋亡和分化等。此蛋白质亦可通过与受体激活(SARA)蛋白的SMAD锚的相互作用被招募到TGF-β受体,从而响应TGF-β信号,被TGF-β受体磷酸化。其相关途径有SMAD2/3在癌症中的功能丧失和心血管疾病发病机制中的假设途径。

Smad2 基因敲除小鼠

图1. Smad2 蛋白结构

 

SMAD2相关疾病介绍

与SMAD2相关的疾病有先天性心脏缺陷、 Loeys-Dietz综合征。

 

心脑血管疾病是心脏血管与脑血管疾病的总称,主要指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所致的心脏、大脑及全身组织发生缺血与出血的疾病。该病的主要致病因素为血管壁平滑肌细胞非正常代谢。心血管疾病多表现为心悸、气短、端坐呼吸、夜间阵发性呼吸困难、胸骨后的压迫性或紧缩性疼痛、胸闷不适等;脑血管疾病的主要症状为偏瘫、偏身感觉障碍、交叉性感觉障碍、共济失调等。

 

研究表明,心脑血管疾病是目前全球死亡和残疾的主要病因,每年3.5亿人因此病残疾失去自理能力,严重影响着人类、尤其是老年人[3]的健康。心脑血管疾病发病机制多种,症状不一,治疗方法亦多种,如:心肌梗死的治疗药物有阿司匹林、P2Y12抑制剂、抗凝剂、β-受体阻滞剂、硝酸盐和他汀类药物等,降血压药物有氢氯噻嗪、螺内酯、可乐定、利血平等[4]

 

Smad2小鼠模型表型介绍

小脑发育异常表型:

研究人员将lox P位点两侧的PGK-neo-poly (A)盒引入Smad2外显子8的下游,在外显子7上游引入了一个额外的lox P位点。通过与Nes-Cre小鼠杂交敲除7~8号外显子序列,产生中枢神经系统(CNS)敲除小鼠(图2)[1]

 

研究结果表明,Smad2-CNS-KO小鼠的小脑在P14时前后轴受损严重,小脑叶状结构缺陷。在E18.5时,对照组小鼠小脑分为四个主裂和五个主叶,而Smad2-CNS-KO小鼠小脑分为两个主裂和三个主叶。在P5时,Smad2-CNS-KO小鼠小脑缺乏小舌沟(图3)。Smad2-CNS-KO小鼠在整个发育过程中小脑分叶异常[1]

Smad2 基因敲除小鼠

图2. Smad2条件性敲除小鼠的产生

 

图注:A:Smad2条件靶向策略的示意图。将lox P位点两侧的PGK-neo-poly (A)盒引入外显子8的下游。在外显子7上游引入了一个额外的lox P位点。箭头表示同源重组体的选择和Cre介导的外显子7和8缺失。B:Smad2的基因分型-CNS-KO小鼠及其同窝仔。通过使用Lox-3S和Lox-2R引物,从flox等位基因产生了500bp的条带,而从对照等位基因产生了351bp的条带。通过使用Cre正向和反向引物,生成了100 bp的条带。C:Smad2-CNS-KO小鼠Smad2蛋白的消融。在野生型小鼠大脑和小脑中检测到Smad2蛋白质,但在P8的Smad2突变小鼠中未检测到(上图)。上条带检测到Smad2 (58 kDa) 的全长(FL)同种型,下条带检测到缺少外显子3的Smad2的短同种型。GAPDH 用作内部对照(下图)。

Smad2 基因敲除小鼠

图 3. 小脑发育异常

图注:A、B:在P14对Smad2-CNS-KO和对照小鼠大脑的总体观察。与对照组相比,Smad2-CNS-KO小鼠的小脑明显更小,暴露的丘脑更多。C~L:在E16.5、E18.5、P5、P14 和P18时通过内侧对照和Smad2-CNS-KO大脑对矢状切片进行H&E染色。在E16.5时,我们发现Smad2-CNS-KO和对照小鼠中存在相似的细胞群。到E18.5,四个主要裂隙和五个主叶在对照小鼠中很明显,并且在突变体中观察到叶化减少。箭头表示在Smad2-CNS-KO小鼠中不出现的裂隙形成小叶(实心箭头)或亚小叶(空白箭头)。箭头表明,与对照小鼠相比, Smad2-CNS-KO 小鼠的第十个小叶似乎很小,并且存在额外的特定小叶。比例尺,200μm。

 

血管异常表型:

研究发现,Smad2fl/fl与Wnt1-Cre杂交可产生神经嵴细胞(NCC)特异性敲除小鼠。结果表明,在胚胎第11.5天时,Smad2 NCC特异性缺失抑制了主动脉弓动脉 III、IV 和 VI 中的血管平滑肌细胞(VSMC)分化,Smad2的缺失降低了主动脉弓中 α-肌动蛋白(α-SMA)的表达(图4)。数据表明,Smad2对VSMC的分化意义中重大[2]

Smad2 基因敲除小鼠

图4. 血管异常表型

 

图注:A:NCC中的Smad2缺失阻断了主动脉弓动脉中VSMC标记基因的表达。野生型(Smad2+/+,左)或Smad2 NCC特异性缺失胚胎第 11.5 天小鼠胚胎(Smad2-/-,右)的矢状切片用苏木精和伊红(H&E)染色或用平滑肌α-免疫染色如图所示,肌动蛋白(α-SMA)或Smad2 抗体。背主动脉(DA)和主动脉弓动脉 III、IV和VI中的 α-SMA 染色分别用箭头表示。NCC中的Smad2缺失阻断了主动脉弓动脉中的α-SMA表达,但不阻断背主动脉 (×40)。B:野生型或Smad2 NCC缺失小鼠主动脉和第四主动脉弓动脉(AAA)中α-SMA表达的更高放大倍数。α-SMA在AAA中被显着阻断,NCC中Smad2 缺失,但在主动脉中没有(×400)。C:NCC中Smad2的缺失不会改变NCC迁移。用 X-gal对携带R26R报告基因的胚胎第11.5天野生型(上)和Smad2 NCC特异性缺失(下)小鼠胚胎进行染色。然后将胚胎石蜡包埋并切片,以观察DA和主动脉弓动脉 III、IV和VI中的LacZ染色,如图所示(右)。Smad2删除不影响NCC迁移到主动脉弓动脉。

 

总结

小鼠SMAD2功能丧失相关的心脑血管疾病具有潜在的临床意义,对这一基因的深入研究有助于进一步探讨心脑血管疾病发病的机制,同时亦可用于此类疾病治疗新方法的研究。

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参考文献:

1. Wang L, Nomura M, Goto Y, Tanaka K, Sakamoto R, Abe I, Sakamoto S, Shibata A, Enciso PL, Adachi M, Ohnaka K, Kawate H, Takayanagi R. Smad2 protein disruption in the central nervous system leads to aberrant cerebellar development and early postnatal ataxia in mice. J Biol Chem. 2011 May 27;286(21):18766-74. doi: 10.1074/jbc.M111.223271. Epub 2011 Apr 4. PMID: 21464123; PMCID: PMC3099693.

 

2. Xie WB, Li Z, Shi N, Guo X, Tang J, Ju W, Han J, Liu T, Bottinger EP, Chai Y, Jose PA, Chen SY. Smad2 and myocardin-related transcription factor B cooperatively regulate vascular smooth muscle differentiation from neural crest cells. Circ Res. 2013 Sep 27;113(8):e76-86. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.113.301921. Epub 2013 Jul 1. PMID: 23817199; PMCID: PMC3837448.

 

3. Moroni F, Ammirati E, Hainsworth AH, Camici PG. Association of White Matter Hyperintensities and Cardiovascular Disease: The Importance of Microcirculatory Disease. Circ Cardiovasc Imaging. 2020 Aug;13(8):e010460. doi: 10.1161/CIRCIMAGING.120.010460. Epub 2020 Jul 28. PMID: 33232175.

 

4. Martin-Ventura JL, Roncal C, Orbe J, Blanco-Colio LM. Role of Extracellular Vesicles as Potential Diagnostic and/or Therapeutic Biomarkers in Chronic Cardiovascular Diseases. Front Cell Dev Biol. 2022 Jan 26;10:813885. doi: 10.3389/fcell.2022.813885. PMID: 35155428; PMCID: PMC8827403.

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