赛业生物搭建的AI平台通过整合大数据、云计算、机器学习等多个技术优化AAV9衣壳蛋白，得到大量的候选变体，结果显示预测的中枢神经系统靶向性数据（图1）可信度高，PearsonR高达0.843。

从AI预测的序列中挑选Top序列进行单个验证，在小鼠体内尾静脉注射（5E11vg/只）后21天检测。活体成像结果显示（图2）Top序列在脑内高度富集，其中PM167脑内表达的Luc信号强度约为PHP.eB的2倍，PM170脑内表达的Luc信号强度约为PHP.eB的1.5倍。

为了进一步探究Top序列在中枢神经系统不同区域的分布情况，又在小鼠体内尾静脉注射（5E11vg/只）后21天检测。冰冻切片结果显示（图3）PM167在各个脑区（皮层、胼胝体、海马、中脑）以及脊髓的绿色荧光蛋白信号均显著高于PHP.eB，PM170在胼胝体以外的各个脑区以及脊髓的绿色荧光蛋白信号也均高于PHP.eB。

Cortex

Corpus callosum

Hippocampus

Midbrain

Spinal cord

 

图3. 体内验证大脑和脊髓感染效率
（冰冻切片EGFP）

赛业生物搭建的AI平台通过整合大数据、云计算、机器学习等多个技术优化AAV9衣壳蛋白，得到大量的候选变体，结果显示预测的肝脏靶向性数据（图4）可信度高，PearsonR高达0.884。

从AI预测的序列中挑选Top序列进行单个验证，在小鼠体内尾静脉注射（5E11vg/只）后21天检测。活体成像结果显示（图5）PM167肝脏负靶向性显著优于PHP.eB，PM170肝脏负靶向性显著优于AAV9野生型（WT），略高于PHP.eB。

在小鼠体内尾静脉注射（5E11vg/只）后21天检测，冰冻切片结果显示（图6）PM167在肝脏的绿色荧光蛋白信号显著低于PHP.eB，PM170在肝脏的绿色荧光蛋白信号略高于PHP.eB，但仍显著低于AAV9野生型（WT）。

利用赛业生物AI-AAV平台，通过构建高库容突变体质粒文库、包装病毒文库、NGS测序，搭建DualConvLSTM网络构建AAV2产量预测模型，经在测试集上验证模型可信度较高，相关性已达Pearson=0.929，Spearman=0.859（图7）；AI构建的视网膜靶向性模型，在测试集上相关性达Pearson=0.874，Spearman=0.871（图8）。

图7. 产量预测模型在测试集上的相关性

图8. 视网膜靶向性模型在测试集上的相关性

利用产量模型和视网膜靶向性AI模型预测产量和表达能力综合评分高的变体，挑选Top序列，构建RC突变体质粒与AAV2野生型质粒、7M8质粒分别包装Luciferase病毒，经病毒包装、纯化、QPCR滴度检测，3个变体的产量均高于AAV2和AAV2.7M8，其中PM054产量最高为AAV2的3.48倍，PM021和PM077产量分别是AAV2的1.5倍和2.01倍。

将包装的Luciferase病毒玻璃体腔注射小鼠，注射剂量为3E+9vg/只眼，3W后通过活体成像和化学发光法检测Luciferase表达情况。活体成像（图10）显示，3个变体Lucifersae信号强度均高于AAV2和AAV2.7M8。为了对其进行更准确的定量，处死小鼠摘取眼球，匀浆后进行化学发光检测，PM054变体Lucifersae表达量最高，为AAV2的15倍，PM021和PM077分别为AAV2的12.5倍和10倍。

图10. 体内验证全眼表达能力（活体成像）

图11. 体内验证全眼表达能力（化学发光）

为了进一步验证变体体内感染效果并探究感染的细胞类型，包装EGFP病毒，玻璃体腔注射小鼠（3E+9vg/只眼），3W后通过活荧光眼底拍照检测EGFP整体表达情况，摘取眼球进行病理检测。眼底拍照结果（图12）显示，PM054的GFP信号最强，3种变体荧光信号均显著高于AAV2和AAV2.7M8。

对眼球冰冻切片进行DAPI染色，结果显示，3种突变体的感染范围均大于AAV2-WT和AAV2.7M8，其中PM021和PM054几乎可以感染整圈视网膜区域。从感染层次看，AAV2-WT仅感染RGC层细胞，AAV2.7M8具有一定的穿透能力，可穿透至视网膜后层感染少量的视神经细胞。3种变体穿透能力均强于AAV2-WT和AAV2.7M8，能感染视网膜从RGC到PRC的各层细胞，其中PM054对视神经细胞的感染率和表达效果最好，感染视网膜后层的能力约为AAV2.7M8的10倍。