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天将降大任于斯鼠也,必先验其真身,然后...

到了,到了,等待数月的基因编辑鼠终于到了,鉴定工作是时候排上日程了。毕竟鉴定工作做不好,后续繁殖建系以及实验只能灰飞烟灭,重头再来。今天我们要讲的主题就是如何来鉴定CRISPR/Cas9构建的基因编辑鼠。

 

我们通常拿到手的基因编辑鼠是F1代杂合阳性鼠,杂合阳性鼠自交的后代会有三种表型(野生型,纯合子,杂合子),需要鉴定纯杂合。接下来就给大家讲一讲不同类型的基因编辑鼠F1代及以后的基因型鉴定吧!

 

基因敲除

 

(1)F1代阳性杂合鼠(+/-)鉴定

 

引物设计:

 

将引物设在敲除片段的两端,野生型小鼠可以扩增出KO鼠缺失的片段。不过需要注意的是,若敲除的片段过大,有的酶是扩增不出来野生型片段的,比如有的酶,1.5K以下基本可以P出条带,大于1.5K的大部分是P不出条带的。

 

引物设计

 

预期片段大小:

假设条带1的大小为:扩增的野生型片段大小

条带2的大小为:扩增的野生型片段大小-敲除片段大小

 

电泳结果:

若是电泳结果有条带2,则为F1代阳性杂合鼠(+/-);

若是电泳结果没有条带2,则为为阴性鼠或野生型鼠(+/+)。

 

电泳结果

 

(2)F2代纯杂合鉴定

 

引物设计:

若是所用的酶可以扩增出野生型的片段,用(1)中的这对引物就可以鉴定出纯杂合;

当敲除的片段过大,而所用的酶无法扩增野生型的条带时,(1)中的这对引物是不能鉴定F2代纯杂合的,所以需要再设计一条引物位于敲除片段内(靠近5’端或是3’端),三条引物一起扩增后电泳。

 

扩增后电泳

 

预期片段大小:

假设条带1的大小为:扩增的野生型片段大小

条带2的大小为:扩增的野生型片段大小-敲除片段大小

条带3的大小为:引物F与引物Wt/He-R扩增的片段大小

 

电泳结果:

野生型的片段可以扩增出来时:

若是电泳结果只有条带2,则为纯合敲除鼠(-/-);

若是电泳结果只有条带1,则为野生型鼠(+/+);

若是电泳结果既有条带1又有条带2,则为F1代阳性杂合鼠(+/-)。

 

野生型的片段

 

野生型的片段不能扩增时:

若是电泳结果只有条带2,则为纯合敲除鼠;

若是2,3两种条带都有,则为杂合敲除鼠;

若是只有条带3,则为野生型鼠。

 

 

条件性基因敲除

 

(1)F1代阳性杂合鼠(+/-)鉴定

 

引物设计:

验证5’arm、3’arm以及loxp:在5’arm和3’arm两端分别设一对引物,扩增的片段包括5’arm或3’arm与loxp位点(图示例子对应的引物为F1/R1;F2/R2)

 

对应的引物为F1/R1;F2/R2

 

预期片段大小:

假设条带1的大小为:F1/R1扩增的片段大小

条带2的大小为:F2/R2扩增的片段大小

 

电泳结果:

若是F1/R1扩增产物的电泳结果有条带1且F2/R2扩增产物的电泳结果有条带2,则为阳性的flox杂合鼠(flox/+);

没有扩增出目的条带的则为阴性鼠(野生型或其它突变)。

 

F1/R1扩增产物

 

F2/R2扩增产物

 

测序:

除了PCR鉴定,还需要进一步测序与目标片段进行比对来确认。F1/R1扩增产物的测序引物设在靠近loxp位点的5’arm上(图示例子对应的引物为F3),F2/R2扩增产物的测序引物设在靠近loxp位点的3’arm上(图示例子对应的引物为R4)。

 

(2)F2代flox鼠纯杂合鉴定

 

虽然F1代flox杂合鼠经验证无问题,但是为了保险起见,F1代阳性鼠自交产生的后代还是要先用(1)中的引物鉴定阳性,再针对loxp位点设计引物来鉴定纯杂合。

 

引物设计:

验证5’arm或3’arm的loxp:在5’arm或3’arm两端设一对引物,扩增的片段包括部分5’arm或部分3’arm与loxp位点(图示例子对应的引物为F3/R3或F4/R4)

 

3’arm与loxp位点

 

预期片段大小:

假设条带1的大小为:F3/R3或F4/R4扩增的野生型片段大小+loxp大小

条带2的大小为:F3/R3或F4/R4扩增的野生型片段大小

 

电泳结果:

若是电泳结果只有条带1,则为纯合flox鼠(flox/flox);

若是电泳结果既有条带1又有条带2,则为杂合flox鼠(flox/+);

若是电泳结果只有条带2,则为野生型鼠。

 

野生型鼠

 

基因插入

 

(1)F1代阳性杂合鼠(KI/+)

 

引物设计:

在插入的片段上分段设计2-3对引物去扩增(鉴于测序前后100bp左右测的不准,故R1,F2,R2,F3位置是交错的),扩增后电泳,为了验证外源 DNA 序列是否正确插入,两边同源臂是否完整无突变,有没有载体的随机整合等,切胶测序进行验证。

 

R1,F2,R2,F3位置

 

预期片段大小:

假设条带1的大小为:F1/R1扩增的片段大小

条带2的大小为:F2/R2扩增的片段大小

条带3的大小为:F3/R3扩增的片段大小

 

电泳结果

 

电泳结果若是1,2,3三种条带都有,且测序结果都与预期符合,则为F1代阳性杂合鼠(KI/+)。

 

1,2,3三种条带都

 

1,2,3三种条带

 

1,2,3三种条带都

 

(2)F2代纯杂合鉴定

 

引物设计:

确认gRNA两边的引物是否可以扩增出野生型目的带即可鉴定纯杂合,用(1)中的引物F1/R3来鉴定。

 

F1/R3来鉴定

 

预期片段大小:

假设条带1的大小为:野生型片段大小

条带2的大小为:野生型片段大小+插入片段大小

 

电泳结果

电泳结果若是只有条带2,则为纯合敲入鼠(KI/KI);

若是除了条带1,还有条带2,则为杂合敲入鼠(KI/+);

若是只有条带1,则为野生型鼠。

 

杂合敲入鼠(KI/+)

 

点突变

 

点突变由于只是单碱基或少数碱基的增加、缺失或替换,在电泳图上突变片段与野生型条带的大小是无法区分的。因此只用PCR是无法鉴定的,还需要结合测序来鉴定。

 

引物设计及预期现象:

选择发生点突变的前后一段片段设计引物(设计引物时,还要考虑一下突变后是否有酶切位点,使酶切点两边的片段大小有区分),将扩增产物电泳后切胶测序。

 

 

若是突变的点之后的序列正好是某种酶特异识别的位点,还可以用酶切实验进行验证。若是有突变,则酶可以特异性识别进行切割,否则酶无法识别进行切割。扩增电泳后回收DNA片段(比如切胶)进行酶切,酶切成功则发生点突变的片段被切为两段,野生型的不会被酶识别切割,可以从PCR图比对片段大小来确认是否酶切成功,进而确认该位点是否突变成功。

 

(1)F1代阳性鼠鉴定

 

F1阳性鼠为杂合子,测序结果可看到突变位置后出现套峰。

 

(2)F2代纯杂合

 

测序结果没有出现套峰且比对序列差异与预期符合的为纯合突变鼠;

 

测序结果在敲除区域或突变位置后出现套峰的为杂合突变鼠。

 

关于CRISPR-Pro基因编辑鼠的鉴定就讲这么多了,祝大家的小鼠给力,快快繁育出更多的阳性小鼠。

 

关于我们

 

赛业生物历经13年发展,已服务全球数万名科学家。赛业产品与技术已直接应用于包括CNS (Cell, Nature, Science)三大期刊在内的2700余篇学术论文。2016年,TurboKnockout把ES打靶金标准推向新高度;同年,CRISPR-Pro使大片段敲入及条件性敲除变得更加高效;2017年,AlphaKnockout基因打靶专家系统首次实现基于人工智能的最优化方案设计;同年7月,推出万例CRISPR-AI敲除小鼠资源库。2018年,CRISPR-AI敲除小鼠资源库突破6800品系,为2000余个课题组提供了高性价比的小鼠模型

 

2019年,为更好的满足客户需求,我们决定启用“CRISPR-AI敲除小鼠资源库”全新的品牌形象——“红鼠”。找小鼠,上红鼠!赛业“红鼠”已包含16000品系基因敲除、条件性敲除及活体小鼠,周期快至2周,只需输入基因名称,一键查询订购。未来赛业将不再局限于提供基因敲除小鼠定制服务,而是将业务板块拓展为科研机构及医药产业提供综合的动物模型制备、保种、生产、供应和信息咨询等服务,以便在更广范围、更大程度、更高层次上推动我国模式动物研究的发展。

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