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基因鼠鉴定方法


    
基因敲除小鼠
 
到了,到了,等待数月的基因编辑鼠终于到了,鉴定工作是时候排上日程了。毕竟鉴定工作做不好,后续繁殖建系以及实验只能灰飞烟灭,重头再来。今天我们要讲的主题就是如何来鉴定CRISPR/Cas9构建的基因编辑鼠。
 
我们通常拿到手的基因编辑鼠是F1代杂合阳性鼠,杂合阳性鼠自交的后代会有三种表型(野生型,纯合子,杂合子),需要鉴定纯杂合。小赛就给大家讲一讲不同类型的基因编辑鼠F1代及以后的基因型鉴定。
 
基因敲除

(1) F1代阳性杂合鼠(+/-)鉴定

● 引物设计

将引物设在敲除片段的两端,野生型小鼠可以扩增出KO鼠缺失的片段。不过需要注意的是,若敲除的片段过大,有的酶是扩增不出来野生型片段的,比如有的酶,1.5K以下基本可以P出条带,大于1.5K的大部分是P不出条带的。

● 预期片段大小

假设条带1的大小为:扩增的野生型片段大小
条带2的大小为:扩增的野生型片段大小-敲除片段大小

● 电泳结果

若是电泳结果有条带2,则为F1代阳性杂合鼠(+/-);
若是电泳结果没有条带2,则为为阴性鼠或野生型鼠(+/+)。

野生型鼠

 

(2) F2代纯杂合鉴定

● 引物设计

若是所用的酶可以扩增出野生型的片段,用(1)中的这对引物就可以鉴定出纯杂合;当敲除的片段过大,而所用的酶无法扩增野生型的条带时,(1)中的这对引物是不能鉴定F2代纯杂合的,所以需要再设计一条引物位于敲除片段内(靠近5’端或是3’端),三条引物一起扩增后电泳。

电泳

● 预期片段大小

假设条带1的大小为:扩增的野生型片段大小
条带2的大小为:扩增的野生型片段大小-敲除片段大小
条带3的大小为:引物F与引物Wt/He-R扩增的片段大小

● 电泳结果

野生型的片段可以扩增出来时:
若是电泳结果只有条带2,则为纯合敲除鼠(-/-);
若是电泳结果只有条带1,则为野生型鼠(+/+);
若是电泳结果既有条带1又有条带2,则为F1代阳性杂合鼠(+/-)。

杂合鼠

野生型的片段不能扩增时:
若是电泳结果只有条带2,则为纯合敲除鼠;
若是2,3两种条带都有,则为杂合敲除鼠;
若是只有条带3,则为野生型鼠。

杂合敲除鼠

 
关于条件性基因敲除基因插入点突变小鼠的鉴定方法。请点击这里>>>
 
今天CRISPR-Pro基因编辑鼠的鉴定就讲这么多了,祝大家的小鼠给力,快快繁育出更多的阳性小鼠。
 
阳性小鼠
 
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