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将引物设在敲除片段的两端,野生型小鼠可以扩增出KO鼠缺失的片段。不过需要注意的是,若敲除的片段过大,有的酶是扩增不出来野生型片段的,比如有的酶,1.5K以下基本可以P出条带,大于1.5K的大部分是P不出条带的。
假设条带1的大小为:扩增的野生型片段大小条带2的大小为:扩增的野生型片段大小-敲除片段大小
若是电泳结果有条带2,则为F1代阳性杂合鼠(+/-);若是电泳结果没有条带2,则为为阴性鼠或野生型鼠(+/+)。
若是所用的酶可以扩增出野生型的片段,用(1)中的这对引物就可以鉴定出纯杂合;当敲除的片段过大,而所用的酶无法扩增野生型的条带时,(1)中的这对引物是不能鉴定F2代纯杂合的,所以需要再设计一条引物位于敲除片段内(靠近5’端或是3’端),三条引物一起扩增后电泳。
假设条带1的大小为:扩增的野生型片段大小条带2的大小为:扩增的野生型片段大小-敲除片段大小条带3的大小为:引物F与引物Wt/He-R扩增的片段大小
野生型的片段可以扩增出来时:若是电泳结果只有条带2,则为纯合敲除鼠(-/-);若是电泳结果只有条带1,则为野生型鼠(+/+);若是电泳结果既有条带1又有条带2,则为F1代阳性杂合鼠(+/-)。
野生型的片段不能扩增时:若是电泳结果只有条带2,则为纯合敲除鼠;若是2,3两种条带都有,则为杂合敲除鼠;若是只有条带3,则为野生型鼠。
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