人类CPA1突变引起小鼠消化酶错误折叠和慢性胰腺炎

原文标题：Human CPA1 mutation causes digestive enzyme misfolding and chronic pancreatitis in mice

期刊：Gut

影响因子：17.943（2018年）

发表时间：2019年1月8日（线上）

选用服务：CPA1点突变小鼠（CPA1 N256K）

研究背景：

尽管体外观察到的结果支持突变诱导的错误折叠和ER应激，但一直缺乏适当动物模型的证据，而CPA1突变的致病机制也是假设的。这限制了研究人员对疾病机制的了解，也阻碍了新型疗法的临床前试验。

为了研究CPA1变体在体内的作用机制，美国波士顿大学的研究人员委托赛业生物通过C57BL/6胚胎干细胞的同源重组将人CPA1突变p.N256K敲入小鼠的Cpa1基因座，制备出CPA1点突变小鼠。

研究思路：

Step 1 检测Cpa1 mRNA和蛋白质的表达

研究人员制备CPA1点突变小鼠（CPA1 N256K）的同时，他们还制备出CPA1 null品系，此品系可作为对照，以区分CPA1蛋白活性丧失或CPA1错误折叠。定量PCR的分析结果表明，与C57BL/6N对照相比，CPA1 N256K品系的Cpa1 mRNA表达降低了30%，而CPA1 null品系则降低了95%。Western blot分析也表明，CPA1 N256K品系的CPA1蛋白含量虽降低但仍然明显，而CPA1 null品系则检测不到CPA1蛋白的表达。

图1. CPA1 N256K小鼠的制备和突变等位基因的表达

之后，他们分离胰腺腺泡并测定CPA1向培养基中的分泌。与野生型的CPA1蛋白相比，CPA1 p.N256K突变体的分泌几乎检测不到。相比之下，腺泡细胞裂解液的western blot分析显示了高水平的CPA1突变蛋白，表明突变蛋白滞留在细胞内。同时，他们也注意到N256K品系的细胞内CPA1蛋白水平略低于对照，表明一些错误折叠和滞留的突变蛋白被降解。

Step 2表型变化

研究人员发现，两种新的CPA1品系都没有表现出明显的表型改变，而且正常繁殖。对于CPA1 N256K突变小鼠，研究人员观察到慢性胰腺炎的标志，包括腺泡细胞萎缩和炎性细胞浸润。Masson三色染色法进一步证实了这一结论，它揭示了CPA1 N256K小鼠腺泡中的广泛纤维化。通过细胞角蛋白19和Sox9的免疫组化染色，他们还观察到腺泡-导管化生（假管复合物）。相比之下，CPA1 null对照组未表现出胰腺疾病的迹象，与C57BL/6N对照小鼠类似。

图2. CPA1 N256K小鼠的纤维化和腺泡-导管化生

Step 3机制验证（ER应激标志物测定）

为了确定CPA1 N256K品系的组织学变化是否与ER应激标志物升高有关，研究人员分别测定了1月龄、3月龄和12月龄小鼠的伴侣蛋白Hspa5（BiP）和转录因子Ddit3（CHOP）。与C57BL/6N和CPA1 null对照相比，CPA1 N256K小鼠的BiP表现出一致但适度的上调，而CHOP在所有时间点表现出明显的上调。

图3. CPA1 N256K小鼠、CPA1 null小鼠和C57BL/6N对照小鼠的内质网应激标志物Hspa5和Ddit3的表达

结论：

该研究的CPA1N256K小鼠表现为自发性和进行性慢性胰腺炎，并在其胰腺中表现出内质网应激的迹象。是第一个与消化酶错误折叠和内质网应激相关的自发性慢性胰腺炎小鼠模型。该模型非常适合测试各种环境因素（酒精，吸烟，高脂饮食）或药物对疾病发病和进展的影响。

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