深度解读新型冠状病毒感染与免疫机制

2019年12月爆发的新型冠状病毒，给我国人民生活带来了巨大的影响。那么，什么是新型冠状病毒呢？人类如何科学防御并治疗冠状病毒呢？相信大家对这个问题既熟悉又陌生，熟悉的是我们身处其中，每天都对这个病毒战战兢兢，陌生的是我们对新冠病毒的了解并不是很透彻，致使截至目前，我们依然没有办法完全消除他的存在。知己知彼，方能百战不殆。要防御和治疗2019-nCoV，我们需要对其感染和免疫机制有深入的了解。

1、冠状病毒是什么

冠状病毒（CoV）是属于Nidovirales的最大病毒组，其中包括冠状病毒科，Arteriviridae, Mesoniviridae和Roniviridae家族。冠状病毒进一步可细分为四个属，即α，β，γ和δ冠状病毒，其中α和β冠状病毒会引起人类的呼吸道和肠道感染，有四种Human-CoV （HCoV 229E、NL63、OC43和HKU1）在全球流行，占成人呼吸道感染的10%至30%。

冠状病毒属的病毒是具有外套膜（envelope）包裹的RNA病毒，其直径约100-160nm，遗传物质在所有RNA病毒中最大。包裹病毒粒子的脂肪膜表面有三个糖蛋白：棘突糖蛋白（S, SpikeProtein,是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点）；小包膜糖蛋白（E, EnvelopeProtein，较小，与胞膜结合的蛋白）；膜糖蛋白（M，MembraneProtein，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成）。少数种类还有血凝素糖蛋白（HE蛋白，Haemaglutinin－esterase）。病毒主要通过Spike蛋白（S蛋白）与宿主细胞受体结合来介导病毒的入侵，并决定病毒的组织或宿主嗜性。冠状病毒S蛋白S1亚单位的N端结构域（S1-NTD）和C端结构域（S1-CTD）都能作为受体结合域（RBD）。一般认为S1-NTD结合糖类受体，S1-CTD结合蛋白类受体。

图1 冠状病毒结构示意图（引自Jie Cui et al. 2019）

冠状病毒的核酸为非节段单链（+）RNA，长27-31kb，是RNA病毒中最长的RNA核酸链，具有正链RNA特有的重要结构特征：即RNA链5’端有甲基化“帽子”，3’端有PolyA“尾巴”结构。这一结构与真核mRNA非常相似，也是其基因组RNA自身可以发挥翻译模板作用的重要结构基础，因而省去了RNA－DNA－RNA的转录过程。冠状病毒的RNA和RNA之间重组率非常高，病毒出现变异正是由于这种高重组率。重组后，RNA序列发生了变化，由此核酸编码的氨基酸序列也变了，氨基酸构成的蛋白质随之发生变化，使其抗原性发生了变化，因此疫苗的研发也受到了限制。

2019年12月在湖北武汉出现的不明原因肺炎病例，经序列测定，专家发现，其与2003年爆发的SARS-CoV病毒存在79.5%的序列同源性，结合电镜下观察的图片，中国疾控中心将引起不明原因肺炎病毒命名为2019-nCoV。2019-nCoV具有冠状病毒的基本特征，是β冠状病毒属。研究者对2019-nCoV样本进行了RNA全长测序，研究发现2019-nCoV在整个基因组中与蝙蝠冠状病毒RaTG13非常相似，整体基因组序列一致性为96.2%。截至目前，专家认为病毒的来源可能为菊头蝠，但最终导致人传人情况的发生，是由于中间宿主的存在以及病毒变异致使其适应人类细胞的生存而导致的。

2、SARS-CoV, MERS-CoV, 2019-nCoV特征及联系

图2 不同冠状病毒基因组，基因和蛋白质（引用Jie Cui et al. 2019）

冠状病毒形成直径为100-160 nm的包膜球形颗粒。它们包含大小为27-32 kb的正链单链RNA（ssRNA）基因组。基因组的5'端三分之二编码一个多蛋白pp1ab，该蛋白进一步被切割成16个非结构蛋白，它们参与基因组的转录和复制。3'末端编码结构蛋白，包括包膜糖蛋白（S），包膜（E），膜（M）和核衣壳（N）。除了编码结构蛋白的基因外，还有一些辅助基因，这些辅助基因是物种特异性的，对于病毒复制是不可或缺的。该图比较了四种冠状病毒属的典型菌株和代表性菌株：猫传染性腹膜炎病毒（FIPV），犀牛蝙蝠冠状病毒HKU2，严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）菌株SAR02和SZ3来自流行早期感染的人，分别来自在SARS流行病的中期和晚期感染的人类的SARS-CoV毒株hTor02，蝙蝠SARS相关冠状病毒（SARSr-CoV）毒株，中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV），小鼠肝炎病毒（MHV），传染性支气管炎病毒（IBV）和球茎冠状病毒HKU11。

严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）是曾引起大规模传染病爆发的冠状病毒。SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV同属于冠状病毒。对于2019-nCoV新发病毒而言，我们对已有相关病毒的了解和研究策略对我们研究2019-nCoV有着重要的意义。

我们知道，SARS冠状病毒（SARS-CoV）是以血管紧张素转化酶（ACE2）作为受体，主要感染纤毛支气管上皮细胞和II型肺细胞。SARS-CoV S蛋白形成了三叶草形的三聚体，具有三个S1头和一个三聚体S2茎。RBD位于每个S1头的尖端。 RBD绑定到ACE2的外表面，远离其锌螯合酶位点。有研究表明，不同的SARS-CoV菌株对人血管生成素受体蛋白（ACE2）的亲和力不同，感染力和传播力也不同。有些菌株感染人类，但并不在人类之间传播，而有些菌株却对人细胞具有高感染力，形成跨物种传播。

图3 SARS- CoV和MERS- CoV的受体识别（引自Jie Cui et al 2019）

1. SARS-CoV使用其受体结合域（RBD）（如hTor02菌株的结构所示，包含核心结构（青色）和受体结合基序（RBM;品红色）结合ACE2（绿色）。 ACE2是一种肽酶，其活性中心带有锌（蓝色）。
2. 宿主和病毒受体中的几个残基，以及两个稳定结构（虚线）形成两个结合热点的连接，这对于SARS流行株hTor02的结合至关重要。
3. 相比之下，SARS相关冠状病毒（SARSr-CoV）株bWIV1是从蝙蝠中分离出来的，可以感染灵猫和人细胞，其残基442、472和487不同。苏氨酸突变为天冬酰胺487号残基中的A引入极性侧链，并会干扰353位点的结合。此处显示的模型是基于hTor02 RBD与人ACE2复合的结构建立的，其中442、472和487位残基从hTor02菌株突变为bWIV1菌株。  
4. 蝙蝠SARSr-CoV株bRsSHC014也可以感染人和果子狸细胞。它在487位上带有丙氨酸，并且该残基的短侧链不支持353的结合。其中442、480和487位残基从cOptimize菌株突变为bWIV1菌株。
5. 中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）RBD（青色的核心结构和洋红色的RBM）结合人二肽基肽酶4（DPP4；绿色）。

而MERS-CoV是以二肽激肽酶4（DPP4;也称为CD26）作为受体，感染未分化的支气管上皮细胞和II型肺细胞。DPP4蛋白作用于物种间氨基酸序列的大量转化。其致病机制是感染下呼吸道并使下呼吸道上皮细胞高度易感，促进巨噬细胞和树突状细胞中病毒的复制生产，诱导促炎细胞因子的产生，靶向T淋巴细胞并导致其凋亡。到目前为止，科学家对于SARS-CoV、MERS-CoV对人体的侵袭研究并没有终止，而如今2019-nCoV的突然爆发加速了科学家对冠状病毒的研究。

2019-nCoV的爆发，是偶然也是必然。根据测序数据显示，它与SARS-CoV有着很高的同源性，它们拥有共同的祖先，其共同祖先与蝙蝠冠状病毒HKU9-1类似。研究发现，2019-nCoV和SARS-CoV都是通过病毒Spike蛋白与人体ACE2受体蛋白结合与宿主发生作用，二者的受体结构域（RBD）高度同源。这里提到的ACE2是个什么蛋白呢？它又有着怎样的功能呢？

在20世纪初的时候Donoghue发现了一种与人类ACE相关的羧肽酶，它是由805个氨基酸组成的I型膜结合糖蛋白，其活化位点位于第374-378位氨基酸残基上，形成一个HEXXH锌结合区，后来我们称之为ACE2，即血管紧张素转化酶2，它是一种能催化血管紧张素I转化为血管紧张素-（1-9）或血管紧张素II转化为血管紧张素-（1-7）的外肽酶，ACE基因表达广泛分布于全身，而ACE2具有高度的组织特异性，主要分布于心脏，肾脏，肺内皮细胞和肾小管上皮细胞，作为一种单羧基肽酶，ACE2能被乙二胺四乙酸（EDTA）抑制。我们发现，ACE2在心脑血管疾病，肾脏疾病中被广泛研究，也作为SARS-CoV和CoV-NL63冠状病毒的受体被研究。

因此，当研究者发现2019-nCoV与SARS-CoV的相关性之后，迅速展开了对ACE2蛋白的探究。我们是否可以在这个受体蛋白中找到突破口使得2019-nCoV即使存在在我们身体里也仅仅只是个过客呢？我们是否能在与病毒Spike变异的竞赛中抢先一步呢？这些都有待于进一步的研究。

3、我们如何防御并治疗2019-nCoV

知己知彼，方能百战不殆。要防御并治疗2019-nCoV，我们需要对其感染和免疫机制有深入的了解。

2020年1月25日，广州中医药大学吴建国团队从免疫的角度提供了新冠状病毒感染和防御的信息，研究者详细表述了病原体识别受体（PRR）、Toll样受体（TLR）、RIG-I样受体（RLR）、NOD-样受体（NLRs）、C型凝集素样受体（CLR）、干扰素以及防御素等作用机制，并列举了细胞参与免疫反应时的响应方式。作者指出，由于冠状病毒周期性地，不可预测地出现，迅速传播并诱发严重的传染病，对人类健康造成极大的威胁。近年来，人们对病毒的固有免疫反应有了深刻的理解。这种类型的免疫反应抑制病毒复制，促进病毒清除，诱导组织修复，并引发针对病毒的长期自适应免疫反应。在大多数情况下，与CoV相关的肺部和全身炎症反应是由先天免疫系统在识别出病毒时触发的。

文中还提到靶向免疫疗法，这是一个新的热点。我们知道，基因靶向免疫疗法即利用基因工程，利用多靶点排毒技术快速识别病毒，强力抑制并破坏病毒DNA核心，破坏病毒的同时采用基因免疫药物，促进宿主细胞抗原打破病毒免疫耐受，使病毒无法再次侵入。目前免疫疗法在癌症中应用很多，我们以这种方式为突破点，或许可以应对目前的2019-nCoV病毒，并对新产生的病毒不再手忙脚乱。

对于病毒与宿主的结合，人类还有哪些探索呢？有研究通过将2019-nCoV蛋白序列与SARS-CoV和BatSL-CoV序列对比，预测生成S1和S2亚基的切割位点位于R694/S695。如下图所示。

图4 2019-nCoV S蛋白功能性结构域图示（引自Shibo Jiang et al. 2020）

• RBD，受体结合结构域； FP，融合肽；HR1，七肽重复1； HR2，七肽重复2； TM，跨膜结构域； CP，胞质结构域。

S1亚基包含两个功能域，N端结构域（NTD）和受体结合结构域（RBD），两者均负责病毒体与宿主细胞上的受体结合。S2亚基包含三个功能域，融合肽（FP）和肽重复序列（HR1和HR2），在S1中的RBD与受体结合后，S2亚基通过将FP插入宿主细胞膜而改变构象，HR1和HR2形成六螺旋束（6HB），导致病毒膜与细胞膜融合。病毒遗传物质通过融合孔进入宿主细胞并在细胞中复制。SARS-CoV S蛋白HR2结构域的肽（SC-1）可以与病毒S蛋白中的HR1区相互作用形成异源6-HB，从而抑制了HR1和HR2结构域之间同源6-HB的形成病毒S蛋白，从而阻断了病毒与宿主细胞的融合。由于2019-nCoV S-HR2序列与SARS-CoV序列具有高度同源性，而在S-HR1区域中只有少数非关键氨基酸突变，因此SC-1肽也有望对2019-nCoV感染有效。研究还发现，中和性单克隆抗体（mAbs）和具有保护功效的纳米抗体是S蛋白的S1亚基的特有化合物，特别是RBD，因此，2019-nCoV S-RBD也可作为2019-nCoV中和单抗的研究目标。

下面讲讲免疫逃逸。为什么要提到这个？因为病毒侵入宿主，其实就是宿主先天免疫与病毒固有免疫的对抗。病毒会抑制先天免疫反应以获得自身有效的复制方式和建立感染的机会。而宿主免疫反应系统又会出现延迟或减弱，或者表现出延迟后过强的诱导作用，导致组织损伤。受影响的先天免疫应答会影响随后的适应性应答，因此病毒先天免疫逃逸常常破坏宿主的保护性免疫，也就构成了感染及发病的过程。

病毒到底行使的是怎样的一个策略呢？病毒会将具有危险性可识别特征的复制中间体与漫游在细胞质中的先天免疫传感器隔离开来。实际上，具有+ RNA基因组的病毒只能在胞质溶胶中复制，例如侵入肺的冠状病毒和鼻病毒，通常会精心修饰细胞内膜以形成病毒RNA复制的总部，也称为“复制细胞器”（RO）。病毒的免疫逃逸机制是如此机智聪明，机体免疫系统不能全部帮我们防御的话，那我们还有些什么策略可以对抗它呢？

病毒很强大，但并不是毫无办法。除了上述提到的靶向免疫疗法、SC-1肽，以及2019-nCoV S-RBD中和单抗，人类在积极的研发疫苗，筛选新的抗病毒药物以及利用基因工程靶向免疫的方式去对抗病毒。这是一场比赛也是一场战争。

首先，对于疫苗的研发，我们要对病毒本身、病毒侵入宿主的方式、宿主的免疫反应要有充分的了解。其次，药物筛选，联合用药要考虑到对机体造成的副反应，即最大程度减少后遗症。再次，我们可以从基因功能层面研究病毒，精准地治疗病毒感染。针对2019-nCoV，有研究表明，冠状病毒Spike蛋白与人类受体ACE2结合之后侵入肺细胞并对呼吸道进行破坏。通过对基因功能分析，研究者发现ACE2+II型肺泡细胞表达多个与病毒组装复制相关的功能基因，具体包括SLC1A5, CXADR, CAV2, NUP98, CTBP2, GSN, HSPA1B, STOM, RAB1B, HACD3, ITGB6, IST1, NUCKS1, TRIM27, APOE, SMARCB1, UBP1,CHMP1A, NUP160, HSPA8, DAG1, STAU1, ICAM1, CHMP5, DEK, VPS37B, EGFR, CCNK, PPIA, IFITM3, PPIB, TMPRSS2, UBC, LAMP1, CHMP3等。研究者认为，这些基因可能被病毒“劫持”之后，以各种模式帮助病毒感染人体。例如CAV2表达Caveolin蛋白，可帮助细胞膜内陷而使得细胞表面的病毒更容易被吞噬到细胞内部。如果能设法基于现有的药物或者研发新的药物干预这些基因的功能，或许可以起到阻断病毒感染的作用。

4、新病毒疫情爆发给我们的启示

微生物与人类的战争从人类诞生起就开始了。人体免疫系统在进化过程中逐渐完善，微生物寻找宿主并利用宿主的能力也变得强大。随着科学技术的发展，人类对生命本身的了解越来越深刻，我们拥有了去应对各种变异病毒和细菌的能力，但是面对新病毒的爆发，我们依然要小心谨慎。管理是人类可为之的一个重要方面，科技特别是现在基因研究的成果应用也是非常重要的一个方面，在努力配合国家指示的同时，我们要更努力的去了解2019-nCoV这个病毒，知己知彼，方能百战不殆。

对于疫情，笔者有更重要的心得，便是，人与自然和谐相处，我们不惊扰了人世的安宁，大自然必馈赠与我们一世的美景。

后记：

病毒研究是个艰巨的探索过程。不论是疫苗研发、新药筛选还是基因治疗，均需要精准的动物模型来验证疾病的发病机制和免疫机制。赛业生物作为一家成熟的动物模型服务商，自疫情爆发以来便紧急召集公司的研发人员全力研发与新型冠状病毒研究相关的动物模型。赛业生物承诺会尽全力开发各种精准的动物模型支持科研人员的研究。众志成城，有爱必胜，相信我们一定能打赢这场没有硝烟的战争。

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