基于SDHB突变自发PC/PG肿瘤的大鼠模型及肿瘤细胞的建立及意义

副神经节瘤（paraganglioma, PG）和嗜铬细胞瘤（pheochromocytoma, PC）都是在自主神经系统中嗜铬细胞中发生的肿瘤。目前研究表明PG/PC遗传因素占40%，其中琥珀酸脱氢酶亚单位SDHB造成的PC/PD的恶性程度是最高的，达到了38%-83%。然而目前对于恶性的PG/PC没有有效的治疗方法，并且，目前还没有琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase，SDH）突变的PC/PG完善模型。近期，有研究人员新研发了两种基于SDHB突变自发PC/PG肿瘤的大鼠模型及相应的肿瘤细胞系，为PC/PG肿瘤的研究提供更好的的动物模型。

背景介绍

PG和 PC都是在自主神经系统中嗜铬细胞中发生的肿瘤。从这个定义来看，副神经节瘤好像归属于嗜铬细胞瘤一样，但其实二者是并列关系，主要区别在于肿瘤起源的部位。嗜铬细胞瘤被定义为起源于肾上腺髓质的嗜铬细胞肿瘤，而副神经节瘤的起源则为肾上腺之外。PC多数情况下具有儿茶酚胺功能活性，而PG这种情况比较少见，由于都是自主神经系统发生了肿瘤且有过量的儿茶酚胺（catecholamine）产生，因此这两种肿瘤的症状常常是共通的，如头痛、出汗、心率加快、焦虑、高血压、颤抖、反胃和体重降低等。虽然总体而言此类肿瘤患病率不算很高，大约为1/300000左右，也并非胰腺癌一样诊断即“死刑”的恶性肿瘤，但放任不管肯定会大大提高其转移和恶性化的风险，此外其症状也会严重影响患者的生活，因此，对其研究和药物开发也必须予以高度重视。

目前研究表明PG/PC遗传因素占40%，并且和其他的肿瘤一样，年龄的增长也会使其发病率提高。很多基因的突变会与PG/PC产生联系，如琥珀酸脱氢酶（DH）亚基SDHB，SDHC 和SDHD ，它们的突变占据了家族性PG/PC的多数, 其中SDHB更是其中的“顶梁柱”，除了上述SDH基因外, 其他与PG/PC相关的基因还有RET、SDHAF2、VHL、NF1、TMEM127、MAX和 SLC25A11等。

图1. 副神经节瘤和嗜铬细胞瘤[1]

SDHA、SDHB、SDHC和SDHD共同构成线粒体内膜呼吸链上的复合体2（Respiratory Complex II，RC2）。而RC2也是唯一一个同时兼职三羧酸循（Tricarboxylic Acid Cycle，TAC）环和电子传递链（Electron transport chain）的重要蛋白复合物。

这四个亚基中SDHA和SDHB位于基质中，作为催化功能单位存在；而SDHC和SDHD则嵌入在线粒体内膜中，负责锚定整个RC2。进一步细分的话，SDHA将琥珀酸转化成延胡索酸（fumarate），同时FAD转化成了FADH2；SDHB接受FADH2的电子，并将电子通过SDHC/SDHD传递给辅酶Q（ubiquinone），从而完成RC2的功能。哺乳动物的琥珀酸脱氢酶除了能量代谢，氧化环境感知这种本职工作之外，也是重要的抑癌蛋白，它们功能失常会导致肿瘤的发生。如前文所述，RC2四个亚基中的三个都与遗传性PG/PC有着密切的关系。尤其是SDHB，其突变造成的PC/PD的恶性程度是最高的，达到了38%-83%，而SDHD突变造成的PG/PC基本为良性，散发性PG/PC恶性率也低于10%。

目前对于恶性的PG/PC没有有效的治疗方法，并且，目前还没有SDH突变的PC/PG完善模型，基于这个原因，开发一种基于SDHB突变的自发PC/PG肿瘤动物以及相应肿瘤细胞系将对该肿瘤的机理研究和药物临床前研发提供很大的帮助。

图2. SDHB的功能[2]

对新构建的SDHB杂合敲除大鼠进行表达验证

与小鼠或其他物种相比，大鼠有很高的概率自发形成PC和PG（不过PC发生的概率比PG高）。在野生型SD大鼠中，最早12月龄就可以自发形成PC，到了24月龄时，PC的患病率可以达到10%，并且还可以人为通过高能量食物，辐照，药物以及激素刺激等方法增加PC的发病率。因此，利用大鼠的这一特性开发SDHB相关的PG/PC肿瘤细胞模型会是一个不错的选择。

研究人员委托赛业生物科技公司用TALEN（transcription activator-like effector nuclease）技术构建了4种SDHB碱基缺失情况不同的大鼠，结果有3种突变成功地遗传繁育下来。对构建好的SDHB缺失大鼠模型进行验证，发现在转录层面，Sdhb+/-大鼠肝脏的SDHB表达正好相当于野生型的50%左右，而蛋白表达则为野生型的68%。而且Sdhb+/-线粒体复合体2的活性也只有野生型的一半了。上述结果说明将SDHB的表达和活性减弱的目的已经达到。

将Sdhb+/-与Sdhb+/-进行交配，可以看到有1/4的胚胎致死率（正好符合纯合Sdhb-/-所占比例），所以用来后续构建肿瘤模型的大鼠只能是杂合子。这说明SDHB对于动物的存活是必须的。经过多次尝试，两种能够进行无限连续移植的PC肿瘤的大鼠脱颖而出。它们都是经过辐照的大鼠，分别命名为RS0和RS1/2。这两种大鼠以及由其PC/PG肿瘤培养而来的肿瘤细胞系将成为后续研究的主角。

图3. Sdhb+/-大鼠SDHB的表达及SDHB缺失造成的影响[3]

SDHB缺失造成的病理改变

如果仅仅是SDHB基因的表达和RC2复合体活性发生改变，还不能成为理想的模型。需要进一步的组织形态验证。免疫组化实验发现RS0经过HE染色后有明显的Zellballen结构（这种结构是PC/PG肿瘤组织的重要特征），有着更清晰的血管结构和细胞结构，和人类PG的形态也非常相似。而RS1/2的细胞则更加弥散。在SDHB和SDHA的染色方面，可以看到RS0的SDHB表达显著低于RS1/2，而SDHA二者都有较高的表达。酪氨酸羟化酶（TH）的染色则是RS1/2更为弥散。总之RS0在病理表型上展现出了多项PC/PG的特征。

不过这里却留给人一个疑问，那就是为什么同是由SDHB杂合子发生了PC/PG的大鼠组织，RS0和RS1/2之间会有如此大的区别呢？尤其是理论上基因型一致的两种大鼠，为什么SDHB的表达差异如此之大。不要急，待到后面讲到全基因组测序（WGS）的时候会公布答案。

图4. 大鼠异种移植PC/PG肿瘤病理结果展示[3]

大鼠PG/PC肿瘤细胞内结构特点

刚才观察的是组织层面的表型，如果我们将视野用电镜聚焦到细胞内，那么可以看到RS0较于RS1/2神经内分泌颗粒（secretory granules，箭头所示）的分布更加弥散，细胞质液泡更大更多（v），这与SDH缺陷的人肿瘤细胞非常类似。另一方面，RS0细胞也与以前的SDH缺陷导致的胃间质瘤一样出现了线粒体细长的现象。与组织层面的结果类似，因此相较于RS1/2，RS0在很多方面都与人的SDH缺陷肿瘤组织具有更为接近的表型。

图5. 大鼠异种移植PC/PG肿瘤细胞内结构展示[3-5]

可传代PC/PG细胞系的获得

表型有了，下一步就是要将肿瘤细胞培养成能够无限传代方便保存的细胞系了。如果用常规RPMI培养液（Roswell Park Memorial Institute Medium）加入10%马血清和5%胎牛血清，并将细胞置于5%氧气培养箱中，RS0细胞的细胞质内会很快产生并聚集液泡进而造成细胞在2周左右死亡；而RS1/2细胞在同样的条件下则不会产生液泡，并可以存活数月，只不过细胞体积会随着细胞接近死亡而缓慢减小。为了让RS0细胞“升级”成细胞系，需要进一步改变培养条件，通过降低血清浓度并降低培养箱含氧量，同时在培养液中加入促干细胞因子，经过多次尝试后，终于培养得到了RS0细胞系。在无血清条件下，RS0能够脱壁悬浮生长并能聚集成细胞团。通过BRDU（检测DNA复制）染色（黑色）可以观察到聚集成团的细胞仍然处于不断增生的状态之中。至此，PC/PG细胞系宣告构建成功，接下来要做的就是进行分子水平的验证了。

图6. 可传代细胞系的表型[3]

肿瘤和细胞系的全基因组测序（WGS）

为了进一步明确RS0和RS1/2细胞系在基因层面发生了怎样的改变，作者对两种细胞系进行了全基因组测序，并与其来源大鼠的正常组织进行了对比。

通过将SDHB外显子1及其上游一共1.4k左右的片段进行比对，发现了RS0细胞系保留了因基因编辑造成的sdhb第1外显子上的13个碱基缺失去，同时还有sdhb基因上游启动子前729bp的丢失，而且与RS0大鼠不同的是，RS0细胞系中的这两处改变都是纯合的，这可能是RS0肿瘤表型明显的原因之一。另一方面RS1/2大鼠来源的肿瘤细胞系则发生了相反的改变，其13bp的缺失恢复成了野生型。

图7. 全基因组测序分析[3]

代谢和蛋白表达炎症

为了进一步确定RS0和RS1/2两种肿瘤的特征，需要继续对RS0和RS1的代谢物进行检测。结果发现两种肿瘤细胞的琥珀酸盐都发生了严重的积累（红框）；乳糖（绿框）或谷氨酸（蓝框）的积累也和SDH相关的人源肿瘤细胞的情况非常类似。如果想用RS0进行PG研究，可以发现RS0具有SDH缺乏型PG的高多巴胺表达，极低的去甲肾上腺素和肾上腺素表达。因此在代谢方面RS0也对PC/PG进行了很好的还原。

HIF2A（Hypoxia Inducible Factor 2 Alpha, EPAS1）的通路发生改变是SDHB突变的遗传性癌症的重要特征，于是在分子方面，作者也对这条信号通路相关RNA和蛋白的表达进行了验证，RNASeq的结果表明HIF2A本身及其下游的Vegfa（Vascular endothelial growth factor A）表达都有10倍以上显著升高。

使用PC12细胞（常用的神经细胞株，SDHB正常）和大鼠甲状腺髓质细胞（Rat Adrenal Medullas, RAM）细胞作为对照，一次性比较肿瘤和细胞系之间基因表达的差异。如果对自发肿瘤进行比较，相较于shdb+/-，sdhb-/-细胞HIF1A的表达提高，SDHB自身的表达降低。如果对各自细胞系与自发肿瘤进行比较，在RS0自发肿瘤中SDHB高表达的情况下则可以发现RS0细胞系中SDHB的完全消失，这与WGS的结果一致，进一步说明RS0细胞系与RS0自发肿瘤的差别。但有意思的是，RS1/2组织中的HIF2A的表达远低于RS0，这种情况在各自细胞系中则发生了逆转，RS1/2细胞系中HIF2A的表达显著高于RS0中。至此，论文已经部分完成了对新建大鼠SDHB相关PC/PG自发肿瘤和细胞系的构建和验证。

图8. 肿瘤移植物的代谢和表达验证[3]

总结

本研究主要有以下三点贡献：

1. 开发了两种基于SDHB突变的自发PC/PG大鼠可移植肿瘤

2. 开发了两种具有不同PC/PG特征（SDHB缺陷和非SDHB缺陷）的肿瘤细胞系

3. 提供了低氧，低血清（或无血清）和干细胞诱导因子结合的肿瘤细胞系构建思路

作者同时为人们提供了可以遗传的自发PC/PG大鼠用于活体肿瘤研究，也提供了便于操作的PC/PG细胞系，能为以后针对SDH突变的PC/PG研究提供了很大的便利。有意思的是，过往的SDHB抑制肿瘤模型和细胞系构建的失败一方面可能是由于太过“纯净”的SDHB敲除而缺乏由于辐照或其他未知原因引起的基因改变；另一方面也可能是过于执着于用小鼠建模，而忽视了更易构建PC/PG模型的大鼠。同时RS0和RS1/2两种不同类型的PC/PG大鼠和细胞系也同时涵盖了SDHB缺失和SDHB表达正常的两种状态，可以使后续的研究更加精细化，类似于PDX的大鼠自发肿瘤更适合用于临床前药物研究，而细胞系则可以在机理的研究中大显身手。相信在不久的未来就能在嗜铬细胞瘤和副神经节瘤的研究过程中发现这些重要模型的身影。

参考文献：

1. https://www.cancer.gov/types/pheochromocytoma/patient/pheochromocytoma-treatment-pdq

2. https://en.wikipedia.org/

3. Powers JF,Cochran B,Baleja JD et, al. A xenograft and cell line model of SDH-deficient pheochromocytoma derived from Sdhb+/- rats[J]. Endocr Relat Cancer 2020

4. Powers J F , Brent C , Baleja J D , et al. A unique model for SDH-deficient GIST: an endocrine-related cancer[J]. Endocrine Related Cancer, 2018:ERC-18-0115-.

5. Szarek E , Ball E R , Imperiale A , et al. Carney triad, SDH-deficient tumors, and Sdhb+/- mice share abnormal mitochondria[J]. Endocrine Related Cancer, 2015, 22(3):345-352.

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