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条件性基因敲除基本原理:Cre/loxP重组系统

日期: 2019年08月20日


    

作为研究基因体内实验的利器,基因敲除小鼠对于科研人员来说自然不是一个陌生的领域。然而,全身性基因敲除的小鼠存在着无法忽视的缺陷,即不能特异性地研究特定基因在特定组织内(及特定的时间)的功能。此外,全身性基因敲除小鼠有时因某些基因对胚胎发育的影响而无法正常分娩,或因出生后严重的生理缺陷而过早死亡,或不能产生后代而不能获得纯合子动物模型。因此,条件性基因敲除小鼠(conditional gene knock out or knock in)应运而生了(well,人就是那么聪明!)。

 

我们在文章中经常看到Cre小鼠,这是一种常用的条件性敲除方法:Cre/loxP重组系统。下面我们就来扒一扒这种方法的原理及应用。

 

1. Cre重组酶和loxP位点:

 

Cre重组酶(Cyclization Recombination Enzyme)由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码,是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。它不仅具有催化活性,而且与限制酶相似,能够特异性识别loxP位点, 从而重组或删除Loxp片段间的基因(图1)。

 

Cre重组酶

 

LoxP(locus of X-overP1)位点长为34bp,包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。其中,反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点,而间隔区域决定了loxP位点的方向(图 1)。

 

2. Cre/loxP系统基因重组原理

 

Cre/loxP系统存在以下几种诱导重组的方式,这是基于Cre重组酶与loxP位点的相互作用而实现的。当基因内存在loxP位点且有Cre重组酶存在时,Cre重组酶便会与loxP位点两端的反向重复序列区结合形成二聚体。此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合,进而形成四聚体。随之,loxP位点之间的DNA序列被Cre重组酶切掉,切口通过DNA连接酶重新连接。DNA重组结果主要取决于loxP位点的方向及位置(图2)。

 

Cre/loxP系统

 

(1)两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同,Cre重组酶敲除(Deletion)loxP间的序列;

 

(2)两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反,Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转(Inversion);

 

(3)两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上,Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换(Cassette change)或染色体易位(Translocation)。

 

3. 应用Cre/loxP系统获取特定基因敲除小鼠

 

应用Cre/loxP系统实现体内某特定基因在特定条件下的敲除,需要两只转基因小鼠。第一只小鼠一般采用胚胎干细胞技术获得,首先在体外构建一个在目的基因两端分别含有一个loxP位点的基因序列,之后将体外构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞内,使其通过同源重组替代细胞基因组内原来的基因序列。经过这样处理的胚胎干细胞被重新植入到假孕小鼠的子宫内,使其重新发育成为一个完整的胚胎,最终成为一只转基因小鼠。在这只转基因小鼠中,loxP位点被引入到相应基因的内含子内,理论上不会对相应基因的功能产生影响,因此一般情况下,该小鼠的表型是正常的。第二只转基因小鼠一般采用卵母细胞注射或者胚胎干细胞技术获得,在这只小鼠中,Cre重组酶被置于某特定基因启动子的调控之下,可以使其在某特定的条件下表达。最后,让这两只小鼠进行交配,产生的同时含有上述两种基因型的子代小鼠就会在某一特定类型的细胞中缺失某一特定的基因(图3)。

 

特定的基因

 

4. Cre/loxP重组系统优势及问题

 

目前,Cre-loxP系统是应用最广泛的条件性基因敲除工具,主要因其因有如下优势:

 

(1)高效性:Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片段形成二聚体后,可提供足够的能力引发之后的DNA重组过程,重组过程简约高效;

 

(2)特异性强: loxP序列的唯一性,保证基因重组的特异性;

 

(3) 应用范围广泛:Cre重组酶是可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用;

 

(4)可由二型启动子启动表达:Cre重组酶的编码基因可由任何一种二型启动子驱动,由此保证Cre重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官或者在不同的发育阶段或不同的生理条件下表达,从而实现较高的组织和细胞特异性。

 

尽管 Cre/loxP 系统具有其独特的优势,但目前其应用主要限于标记基因的删除或者是外源基因的定点整合,该系统在整合与删除方面也仍存在缺陷。虽然标记基因选择性地被切除,但在 Cre 酶切口处留下了一段 34 个碱基对长的 loxP 位点,这样就仍然含有冗余的外源 DNA 序列。此外,该系统融合 2 个位点的反应机制还缺乏理论依据。

 

总之,Cre/loxP 位点特异性重组系统已使精确设 计的遗传修饰成为可能,不仅可以精确地引入外源基 因,还可以设定遗传开关在时空上控制外源基因的表 达与缺失,显示了巨大的应用前景。虽然目前其研究 和应用仍存在诸多不足,但随着技术的发展,这一系 统定会日臻完善,其应用亦会更加广泛。

 

本文来自“上海十院IBD团队(作者:杨文静,陈良)”,转载的目的在于分享见解。如有侵权,请告知删除!

 

【赛业生物科技简介】

作为实力雄厚的基因工程鼠技术平台,赛业生物已服务全球数万名科学家,赛业产品与技术已直接应用于包括CNS(Cell, Nature, Science)三大期刊在内的2800余篇学术论文。2016年,TurboKnockout把ES打靶金标准推向新高度;同年,CRISPR-Pro使大片段敲入及条件性基因敲除变得更加高效;2017年,AlphaKnockout基因打靶专家系统首次实现基于人工智能的最优化方案设计;同年7月,推出万例CRISPR-AI基因敲除小鼠资源库。赛业一步一个脚印,踏实前行,助力中国科研!

 

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