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《鼠年说鼠》第十七期:如何鉴定CRISPR/Cas9点突变小鼠、转基因鼠以及ES打靶技术构建鼠?


    

《鼠年说鼠》系列文章,每周二更新,专门解答大小鼠铲屎官们在养鼠过程中经常遇到的繁育与鉴定类的问题,同时向大家征集问题,任何基因编辑鼠饲养繁殖或鉴定的困惑统统可以丢给小赛,小赛会给您回复或统一在后面的内容为大家做出详细的解答。

 

基因工程小鼠基因型PCR鉴定的基本原则是利用基因工程小鼠基因组与野生型小鼠基因组的序列差异,以小鼠基因组DNA为模板进行PCR,并以凝胶电泳对比不同基因型特异产物的大小,根据条带大小来区分小鼠的不同基因型。上期我们讲述了CRISPR/Cas9基因敲入鼠的鉴定,今天我们就来学习CRISPR/Cas9点突变小鼠、转基因鼠以及ES打靶技术构建鼠的鉴定。

 

如何鉴定CRISPR/Cas9点突变小鼠、转基因鼠以及ES打靶技术构建鼠?

 

一、CRISPR/Cas9点突变小鼠如何鉴定?

点突变由于只是单碱基或少数碱基的增加、缺失或替换,在电泳图上突变片段与野生型条带的大小是无法区分的。因此只用PCR是无法鉴定的,还需要结合测序或者酶切来鉴定。

 

1. 引物设计

选择在发生点突变的上下游片段设计引物,设计引物时,还要考虑一下突变后是否有酶切位点,使酶切点两边的片段大小有区分。先进行PCR扩增,再将扩增产物电泳后切胶或者测序。若是突变的点之后的序列正好是某种酶特异识别的位点,还可以用酶切实验进行验证,酶切成功则发生点突变的片段被切为两段,野生型的不会被酶识别切割。若没有引入酶切位点的,就只能通过将PCR产物测序,然后通过峰图分析目的碱基是否有突变。

引物设计

 

2. 预期片段大小及电泳结果

使用F/R扩增,条带1的大小为野生及阳性的条带,切胶回收送测。

预期片段大小

电泳结果

 

二、转基因鼠如何鉴定?

转基因鼠由于技术的局限性,存在拷贝数和插入位点不确定的问题,只能判断阳性。一般设计3对以上的引物,若同时鉴定为阳性则判断为阳性鼠。繁殖过程中,建议不同line的F0与WT分别传代,再通过表达量的验证筛选出最佳传代的line。

 

三、ES构建的鼠如何鉴定?

使用ES技术构建的鼠,鉴定方法与设计原理与CRISPR/Cas9的相似。ES技术利用了Neo筛选,赛业的TurboKnockout技术可以获得自删该元件的F1代小鼠,不需要再对Neo进行验证。

 

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点突变小鼠3.8万直降

 

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