四川大学研究团队解析生物材料的骨诱导机制

四川大学生物材料工程研究中心的研究团队在Acta Biomaterialia杂志上发表了题为“Correlations between macrophage polarization and osteoinduction of porous calcium phosphate ceramics”的文章，揭示了磷酸钙陶瓷的骨诱导与巨噬细胞极化之间的关联。这些结果不仅加深了人们对骨诱导机制的了解，也有助于设计新型的骨诱导支架。生物材料工程研究中心的肖玉梅和梁洁为共同通讯作者。

研究背景

如今，生物材料的固有骨诱导已经被广泛接受。例如，磷酸钙（CaP）陶瓷可以在没有外源细胞和生长因子的非骨部位诱导异位成骨。尽管这种骨诱导作用具有巨大的临床潜力，但其内在机制还没有完全弄清。

骨免疫学领域的研究表明，免疫细胞在维持骨稳态和调节骨重建中起着至关重要的作用。有证据表明，免疫系统和骨骼系统共享许多调控分子，包括细胞因子、趋化因子、受体和转录因子。生物材料在植入后会不可避免地引发宿主反应，且炎症程度会影响植入物的性能，特别是骨诱导性。

巨噬细胞作为固有免疫系统的第一道防线，在此过程中发挥重要的作用。它不仅具有吞噬作用，还可以分泌趋化因子和细胞因子来调节炎症程度。此外，巨噬细胞表现出明显的可塑性，可根据环境变化而显示出一系列不同功能的极化表型。M1型和M2型是目前广泛研究的两种表型，分别具有促进炎症以及减轻炎症和促进细胞修复的作用。

先前有研究表明，骨科材料会影响巨噬细胞的极化。基于此，研究人员利用小鼠肌内植入模型和三种常用的磷酸钙陶瓷材料，以证明巨噬细胞极化在材料诱导的骨形成中起着关键作用。

三种CaP陶瓷的骨诱导作用

在这项研究中，研究人员选择了三种多孔结构的磷酸钙陶瓷，包括羟基磷灰石（HA）、双相磷酸钙（BCP）和β-磷酸三钙（β-TCP）。他们通过手术将多孔CaP圆柱体植入BALB/C小鼠肌肉内，并在90天后评估CaP陶瓷的骨诱导作用。少数HA样本（2/7）和多数BCP样本（6/7）中观察到异位骨形成。然而，β-TCP样本中未观察到骨形成，其孔内充满了纤维状和脂肪样组织。

为了评估免疫细胞浸润，研究人员在植入后第7、14和21天提取样本，并通过HE和免疫荧光染色观察。随着植入时间的延长，大量细胞（尤其是F4/80+ 巨噬细胞）从CaP陶瓷的表层区域（区域1）迁移到内部区域（区域3）。不过，BCP组的F4/80+ 巨噬细胞数量随时间急剧减少，而β-TCP组中巨噬细胞的数量逐渐增加。

体内分析CaP陶瓷诱导的巨噬细胞极化

研究人员首先对组织切片进行免疫荧光染色，以研究体内巨噬细胞极化。在植入初期（第7、14和21天），β-TCP组的iNOS+ M1型巨噬细胞比例最高，而BCP组的ARG+ M2型巨噬细胞比例最高。对于β-TCP组，他们发现M1/M2比例逐渐增加，且M1型巨噬细胞数量更多，而BCP组在第7、14和21天都有更多的M2型巨噬细胞。

图1. 在植入后对M1和M2表型标志物进行免疫荧光染色

之后，他们又利用RT-qPCR技术评估了M1型标志物（iNos）和M2型标志物（Arg）的基因表达。在第7天，BCP组的iNos和Arg mRNA表达量最低，不过到了第21天，BCP组明显上调了Arg基因表达，并下调了iNos基因表达。这些结果表明，骨诱导能力出色的BCP陶瓷能够诱导M2型巨噬细胞极化。相反，没有明显骨诱导性的β-TCP陶瓷促进了iNOS+ M1型巨噬细胞。

体外分析CaP陶瓷调控的巨噬细胞行为

为了深入了解其免疫调节特性，研究人员又在体外研究了CaP陶瓷对巨噬细胞行为的影响。他们利用扫描电镜观察了在三种CaP陶瓷上生长的巨噬细胞的形态。电镜图像表明，HA和BCP上的大多数巨噬细胞开始伸长，呈纺锤状，而β-TCP上的大多数巨噬细胞保持球状或椭圆状。这些结果表明，β-TCP陶瓷抑制了巨噬细胞的扩散和伸长。

他们还利用RT-qPCR 分析和多重免疫检测定量了炎症相关细胞因子和趋化因子的表达。结果发现，β-TCP明显上调了M1表型标志物的表达，促进巨噬细胞分泌IL-1β、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β。相反，BCP上调了M2表型标志物（Arg和Il10）的表达，并增加了CD206+ M2型巨噬细胞的比例。这些结果与体内研究一致，表明β-TCP和BCP分别将巨噬细胞推向M1和M2表型，而HA对巨噬细胞极化没有偏向。

图2. 炎性细胞因子和趋化因子的体外相对表达

此外，研究人员还分析了巨噬细胞分泌因子对成骨的影响。他们利用来自巨噬细胞/CaP上清液的条件培养基来培养骨髓间充质干细胞（BMSC）。结果表明，与纯培养基相比，培养基中钙离子和磷离子的消耗降低了BMSC的增殖。对于HA、BCP和β-TCP组，小鼠BMSC的增殖和成骨基因表达相当。本研究中的BMSC由赛业生物提供。

总的来说，这些结果表明，骨科植入物的骨诱导能力与炎症反应密切相关，这是由植入物调控的巨噬细胞极化和功能状态决定的。这项研究为了解生物材料的骨诱导机制奠定了基础。它也有望帮助人们设计出骨诱导支架的新策略。

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