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下篇——慢病毒包装,这可能是你最关心的问题

下篇——慢病毒包装,这可能是你最关心的问题 | 赛业生物

 

慢病毒(Lentivirus,LV)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)改造而来的一种病毒载体,属于逆转录病毒。慢病毒可将特定基因片段随机、稳定地整合到宿主细胞的基因组中,实现目的基因的持续稳定的表达目的产物,因此,目前慢病毒载体已经广泛地应用于基因的表达调控如过表达,干扰和基因敲除。

 

然而,在做病毒包装实验中,科研工作者常遇到一些问题,赛业生物具有多年分子生物学和细胞生物学相关实验技术的研究经验的细胞生物学产品经理针对常见的问题整理了一份慢病毒包装FAQ,希望能解答您关于慢病毒包装的困惑,上篇回顾请点这里:上篇——慢病毒包装,这可能是你最关心的问题。今天我们接着进行慢病毒包装常见的问题解答:

 

慢病毒载体最大可插入多大的片段?

慢病毒载体的载量为6-6.5kb左右,但一般建议插入的片段大小不超过5kb,这样包装出来的病毒滴度较高,若超过6kb则会显著降低病毒滴度。实际病毒包装中,我们常需要插入报告基因(如GFP)和抗性基因(如Puro),这使得目的片段的容量进一步缩小至3kb左右。

 

我们目前通过载体优化,例如删去不必要的基因,减小启动子长度,可使目的基因的片段容量扩大到4kb左右。

 

怎么确认我的细胞需要多少病毒量才够?那么多规格我该怎么选?

由于慢病毒的感染谱很广,可以感染分裂期和非分裂期的细胞,对于大部分的细胞类型,采用1×108 TU/ml的规格即可满足要求,另外由于目前慢病毒多用于体外细胞的感染而少用于体内注射,因此非纯化亦可。

 

对于难感染的细胞,如原代细胞,需要较高的MOI,需要的病毒量也较多,建议选高规格,如1×108 TU/ml。

 

对于较为少见的细胞类型所需要的病毒量,可通过参考文献或预实验确定。

 

你们是用什么方法来检测病毒滴度的?可靠吗?

在上篇有讲到,慢病毒滴度的测定方法主要有4种,即Elisa法检测病毒颗粒中p24蛋白,PCR法检测病毒颗粒RNA和检测整合到基因组的病毒DNA,以及通过FACS检测荧光蛋白的表达水平。

 

我们采用的是定量PCR检测整合到细胞(293T)基因组中病毒DNA的方法,此方法的检测结果相对准确。因为ELISA和检测病毒RNA的方法检测的只是病毒颗粒的量,包括无活性的病毒颗粒,这会使得滴度检测结果偏高,而我们实验是需要有活性的慢病毒才能发挥转染作用;FACS法所检测的荧光蛋白则受到启动子及荧光蛋白在目的细胞表达水平的影响,会使得检测结果偏低。

 

都能转染细胞,LV和AdV选哪个?

慢病毒由于可以插入细胞基因组,可以实现目的基因的持续稳定的长时间表达;而腺病毒不整合到基因组,表达时间相对于慢病毒较短,一般两三周这样。

 

腺病毒的感染效率很高,显著高于慢病毒,大部分细胞的感染效率均能达到95%以上,所以对于“顽固”细胞,可以考虑用腺病毒。

 

慢病毒的包装周期相对较短,一般一个半月左右,但包装的病毒滴度也相对较低(一般108 TU/ml);腺病毒包装则较为繁琐,通常需要2个月或以上,一般可达到1010 PFU/ml以上,纯化后可达1012 PFU/ml,且纯化后的腺病毒可直接用于体内注射,但免疫原性较高。我们需根据两者特性综合选择。

 

如果我想在你们公司包病毒,需要提供什么?

(1)基因的ID和序列;

(2)所需要病毒的滴度及总量(我们有1×108 TU/ml及以上的各种规格供选择),以及是否需要纯化;

(3)(非必要)实验目的及准备用病毒进行的下游实验,这样可以更方便我们根据您的需求制定方案。

 

多久能拿到LV?拿到后怎么保存?

一般情况,慢病毒包装整个过程包括载体构建(2~3周),病毒包装+扩增(1~2周),检测(约1~2周),顺利的话4周左右可以拿到病毒,慢的话不会超过6周。

 

收到病毒后若要长期保存则需放入-80℃冰箱,可保存一年左右;若一周内可以用完,则放入4℃冰箱即可。慢病毒应尽量避免反复冻融,理论上每次冻融会让病毒活性降低5~10%,因此对于冻融的病毒,使用前建议重新进行滴度检测,或考虑分装使用。

 

以上就是做病毒包装实验中,科研工作者常遇到一些问题及解答,希望对大家有所帮助。在细胞基因编辑实验中,你还有哪些问题和困扰?欢迎联系我们,我们会在“细胞基因编辑小课堂”后面的微信公众号推文为大家进行解答哦~

 

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