Molecular Cell：线性泛素化调控血管生成的新机制

军事科学院军事医学研究院生命组学研究所的张令强团队和贺福初团队联合哈佛大学医学院的魏文毅团队和中科院微生物所的刘翠华团队近日在Molecular Cell杂志上发文，解析了线性泛素化调控血管生成的新机制。

泛素化通过泛素链与底物的结合来控制蛋白质降解和信号转导，最终影响每一个细胞过程。通过N端甲硫氨酸残基（M1）连接形成的泛素链又称为线性泛素链，在NF-kB介导的炎症和免疫应答中起着至关重要的作用。

线性泛素链组装复合物（LUBAC）由泛素连接酶HOIP和两个调节亚基HOIL-1L和SHARPIN组成，负责在NEMO、RIPK1、RIPK2等底物上形成线性泛素链。OTULIN则是一种特异性去除线性泛素链的去泛素化酶。OTULIN与LUBAC协同作用，编辑线性泛素链，在胚胎发育、自身免疫和炎性疾病等过程中起作用。然而，线性泛素化调控血管生成的具体机制仍不清楚。

ALK1是线性泛素化修饰的底物

为了确定线性泛素链在胚胎发育中的生理功能，研究人员首先生成了Otulin缺陷型小鼠。他们发现，OTULIN全敲除和血管内皮细胞敲除小鼠均在胚胎E13.5天死亡，并且存在畸形的血管结构。相比之下，OTULIN心内膜敲除小鼠则正常出生，没有血管生成缺陷。因此，他们认为内皮细胞（endothelial cells, EC）中的OTULIN是胚胎发育血管生成所必需的，其缺失导致严重的血管生成缺陷，尤其是动静脉畸形。

在研究背后的机制时，他们发现E12.5天时Otulin-KO胚胎中Smad1/5的C端磷酸化降低，而Smad2/3和Smad1的MH1-MH2接头的C端磷酸化没有改变。这可能解释了Otulin-null表型。之后他们筛选了Smad1/5的I型受体，发现只有ALK1被线性泛素链特异性修饰。后续的一系列实验表明，ALK1是线性泛素化修饰的特异性底物。

图1. 用anti-Flag抗体免疫沉淀细胞裂解液。使用免疫印迹法检测免疫沉淀物以检测线性泛素化。NEMO 用作阳性对照。

ALK1的线性泛素化降低下游Smad1/5信号传导

研究人员发现，HOIP抑制剂11a限制了ALK1上线性泛素链的形成。为了在体内证实这些结果，他们用BMP9（ALK1刺激物）来处理原代HUVEC细胞，并使用11a来抑制线性泛素链的形成，发现Smad1/5磷酸化和下游靶标的表达被抑制剂11a所增强。相反，泛素连接酶HOIP的异位过表达减弱了Smad1/5磷酸化和下游靶标表达。之后，通过突变体构建和结构生物信息学分析，他们证明ALK1的线性泛素化会抑制ALK1的激酶活性，降低ALK1- Smad1/5信号传导。

既然如此，那么OTULIN是否对ALK1进行去泛素化，继而促进Smad1/5激活？他们发现，正如预期的那样，OTULIN切割了LUBAC催化的ALK1上的线性泛素链。体外和体内实验均表明，OTULIN的缺失促进了ALK1的线性泛素化，并伴随着Smad1/5磷酸化和下游靶标表达的降低。这些结果表明，OTULIN从ALK1上切割线性泛素链以释放ALK1激酶活性，并促进Smad1/5激活。

接着，为了证实ALK1是线性泛素化的真正生理靶点并导致Otulin-null敲除胚胎致死，研究人员打算在E12.5 Otulin-null胚胎中的ALK1激酶活性被限制之前补偿ALK1-Smad1/5信号强度，以挽救Otulin-null胚胎的表型。他们提前在怀孕小鼠腹膜内注射BMP9，发现Otulin-null胚胎的存活时间延长。为了进一步确认减弱的ALK1激酶活性是否是在E13.5观察到的胚胎致死的原因，他们还委托赛业生物构建了EC条件性敲入小鼠ALK1^Q200D（小鼠ALK1的Q200D突变导致ALK1组成型激活），发现这些胚胎的存活时间显著延长。这些实验表明，Smad1/5磷酸化的增强是Otulin-null胚胎存活所必需的，而BMP9刺激或ALK1的组成型激活可延长这些胚胎的存活时间。

图2. 通过注射BMP9以及EC条件性敲入ALK1^Q200D可以延长Otulin EC-KO胚胎的存活时间。

HOIP抑制剂可挽救患者来源EC的异常表型

之前的研究表明，ALK1中的突变会引起2型遗传性出血性毛细血管扩张症（HHT2），这是一种常染色体显性的血管疾病，患者因动静脉畸形而在多个部位出现明显的血管病变。因此，研究人员想了解HHT相关的ALK1突变是否会影响ALK1与HOIP之间的相互作用以及随后的ALK1线性泛素化。

他们筛选了25例携带ALK1突变的HHT患者家系，发现一对母子携带了ALK1 G309S突变。后续分析表明，ALK1^G309S突变体表现出过度的线性泛素化以及与HOIP的相互作用增加，这导致ALK1^G309S的激酶活性较低。随后，他们利用患者的外周血单核细胞制备出诱导多能干细胞，然后诱导其分化为内皮细胞，并发现HOIP抑制剂11a能够校正患者的异常表型。

小结

总的来说，作者通过一系列的实验，证实了OTULIN与LUBAC协同作用，通过特异性编辑ALK1的线性泛素化来平衡内皮细胞的血管生成。ALK1的过度线性泛素化对血管内皮细胞有害，并导致Otulin-KO小鼠的血管生成缺陷和胚胎致死，这可以通过BMP9处理和ALK1激活来挽救。此外，HOIP抑制剂可使内皮ALK1-Smad1/5正常化，从而有效对抗与HHT发病相关的内皮细胞中的血管生成缺陷。

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原文检索：

Fu et al., OTULIN allies with LUBAC to govern angiogenesis by editing ALK1 linear polyubiquitin, Molecular Cell (2021), https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.05.031

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