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CAR-T细胞治疗的研究路线分析

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor, CAR)T细胞疗法在白血病和淋巴癌的治疗中已经取得了长足的进展。2012年,罹患急性淋巴细胞白血病的7岁女孩Emily Whitehead接受了全球首例CAR-T疗法的临床实验,被成功治愈;2017年,美国食品药品监督管理局(FDA)批准了全球首个CAR-T疗法,使这一领域进入了创新研究的快速发展期;2021年,国内两款CAR-T药物先后获批上市,售价为120万-129万元一针,在国内引起广泛的关注。

本文将为大家带来CAR-T细胞治疗研究路线的解析,讨论各阶段在 CAR-T 细胞疗法研究中的重要作用。

 

图1. Emily Whitehead,全球首位接受CAR-T治疗且被成功治愈的白血病患者,目前已经无癌生存9年。

图源:https://emilywhiteheadfoundation.org

 

什么是CAR-T细胞疗法

CAR-T细胞疗法需要从患者身上抽取血液并分离出T细胞,对T细胞进行活化并通过细胞转染(通常为病毒转染,CRISPR/Cas等技术也有报道[1]),使其在表面表达嵌合抗原受体(CAR),以特异性识别肿瘤抗原。接下来,将CAR-T细胞扩增并回输至患者体内,达到治疗癌症的目的。

 

图2. CAR-T细胞治疗流程图。

图源:https://www.malaghan.org.nz/

 

CAR-T细胞治疗在近几年一直是很热门的领域。目前临床研究中,中国和美国是两个主力国家。我国开展CAR-T疗法的研究起步晚,但在2017年超越美国,成为世界上正在进行临床研究最多的国家。目前针对CAR-T细胞治疗的临床研究主要集中在临床Ⅰ期和Ⅱ期,临床Ⅲ期则是一些已经上市的药物。表1列举了自2017年以来获批上市的CAR-T产品,主要针对白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤的治疗。我国在2021年6月和9月分别批准两款针对CD19靶点的CAR-T产品上市。

品种

企业

靶点

获批时间

获批适应症

Kymriah

诺华

CD19

2017.08

复发或难治性前体B淋巴细胞白血病,复发性或难治性大B细胞淋巴瘤患者

Yescarta

Kite(Gilead)

CD19

2017.10

复发性或难治性大B细胞淋巴瘤患者

Tecartus

Kite(Gilead)

CD19

2020.07

复发或难治性套细胞淋巴瘤

Breyanzi

Juno Therapeutic

CD19

2021.02

复发或难治性大B细胞淋巴瘤

Abecma

BMS/蓝鸟生物

BCMA

2021.03

成人多发性骨髓瘤

阿基仑赛

复兴凯特

CD19

2021.06

复发性或难治性大B细胞淋巴瘤成人患者

瑞基奥仑赛

药明巨诺

CD19

2021.09

用于治疗经过二线或以上系统性治疗后成人复发或难治性大B细胞淋巴瘤

表1. 已经上市的CAR-T产品列表

 

CAR-T细胞治疗的基本研究路线

1. 靶点发现和选择

肿瘤抗原的分类有三种:

(1)细胞谱系抗原,这种抗原在特定的细胞谱系中表达,如B细胞谱系抗原CD19、CD20等;

(2)肿瘤特异性抗原,这种抗原仅在肿瘤细胞上表达,特异性高,是最理想的治疗靶点;

(3)肿瘤相关抗原,在肿瘤细胞和组织中高表达,但在正常组织中有限表达,这类抗原是目前研究得最多的一类抗原。

 

为了使CAR-T细胞特异性攻击癌细胞而不攻击自身正常的细胞和组织,因此靶点选择的标准是:肿瘤细胞和组织高表达;正常组织不表达或者低表达。

 

因为实体瘤微环境等因素对CAR-T疗效的制约,CAR-T细胞治疗的研究常被分为血液瘤和实体瘤两部分。目前上市的7种CAR-T药物均是针对血液瘤的靶点,而血液恶性肿瘤仅占所有恶性肿瘤的10%左右[2]。由此可见,血液瘤和实体瘤的CAR-T研究难易度差异巨大。血液瘤研究中最常用的靶点是CD19,针对白血病和淋巴癌;其次是BCMA,用于多发性骨髓瘤的治疗研究。实体瘤中常研究的靶点有间皮素(Mesothelin)、MUC1和GPC3等。

 

图3. CAR-T临床试验中各类靶点的试验数量[3]。上:血液瘤中靶点的研究;下:实体瘤中靶点的研究。

 

2. CAR分子设计

特异性免疫是人体抵抗病原体攻击的第三道防线:病原体侵入人体后,刺激淋巴细胞产生抗体,引起一系列的免疫反应。科学家将抗体特异性识别抗原的特性,与T细胞受体(T Cell Receptor, TCR)活化T细胞的特性结合起来,这就是CAR分子设计的基本原理。

 

目前科学研究中已经定义了4代CAR分子结构:

(1)第一代CAR分子由三部分组成,第一部分是来自抗体的抗原识别单链可变区(scFv),第二部分是跨膜区,第三部分则是来自内源性TCR的细胞内信号结构域CD3ζ分子;

(2)第二代CAR分子在第一代的基础上增加了共刺激结构域,共刺激结构域在跨膜区和信号结构域CD3ζ分子之间,不同的共刺激结构域会使CAR-T细胞向不同的方向活化。目前FDA批准的CAR-T产品都是第二代设计,带有CD28或4-1BB共刺激结构域;

(3)同时包含两种共刺激结构的CAR分子,则被称为第三代CAR;

(4)第四代CAR增加了增强T细胞功能的修饰,比如使T细胞产生额外的蛋白质(如细胞因子)或拥有额外的受体等。

 

图4. 1-4代CAR分子结构示意图[5]

 

CAR分子构建可以在各代CAR结构的基础上进行调整和优化,例如:

(1)scFv的选择:scFv选择的重点是特异性,如果和靶点外的蛋白有交叉反应,则出现脱靶效应的概率会比较大。一般来说, CAR分子需要合适的亲和力,太高或者太低都会影响CAR-T细胞的效果,所以需要进一步设计实验筛选出具有合适亲和力的CAR分子;

(2)连接基团(Linker)的优化: Linker是连接scFv的重链(VH)和轻链(VL)的区域,Linker通常来自于重复的甘氨酸和丝氨酸残基[4],因此它的长度上面还有可优化的空间;

(3)铰链区Hinge的选择:铰链区(Hinge)连接着识别抗原的胞外域和跨膜区,它影响胞外域和细胞膜的空间位置,该区域需要具备一定的灵活性来允许scFv结合抗原;

(4)共刺激结构域的选择:不同的共刺激分子具备不同的特性,表2翻译自诺华官网,列举了两种常见的共刺激结构域4-1BB和CD28的不同之处。

 

4-1BB

CD28

增强CAR-T细胞扩增和持久性存在

增强CAR-T细胞的早期扩增和快速扩增

体外实验已证明可诱导中央记忆T细胞的分化,提高增殖潜力

体外实验证明和效应记忆T细胞的分化有关,提供及时保护

可能会阻止CAR-T细胞耗竭

有限的持久性存在,并且会造成CAR-T细胞的快速耗竭

表2. 共刺激结构域4-1BB和CD28的功能。

 

3. CAR-T细胞构建

T细胞的活化和扩增,CAR-T细胞的构建和稳转细胞株构建类似。然而, T细胞一般处于静息状态,需要先对T细胞进行活化激活。CAR分子和载体设计好后,就可以开始进行CAR-T细胞的构建。

 

慢病毒转染,由于免疫细胞的特殊性,对T细胞进行慢病毒转导所需的病毒纯度要高于普通稳转株。CAR-T细胞的一般构建方式是:首先将外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)进行分离和活化。1-2天后用慢病毒转导,后期进行CAR-T细胞的扩增和鉴定。

 

图5. CAR-T细胞构建流程。

 

CAR-T细胞体外杀伤效果评价

CAR-T细胞体外杀伤实验通常是将CAR-T细胞和靶细胞共孵育,然后进行一系列的评估。靶细胞有两种来源,一类是天然表达抗原的肿瘤细胞系,还有一类是人为构建的表达抗原阳性的稳转细胞株。人为构建稳转株的主要方式是慢病毒法,构建好病毒载体后,转染细胞(如293T细胞),使细胞正常表达或者过表达抗原。

 

CAR分子识别抗原后,会释放 T 细胞效应反应,包括增殖、细胞因子释放、代谢改变和细胞毒性等。CAR-T 细胞被认为主要通过分泌颗粒酶和穿孔素发挥其细胞毒性的功能[4]。细胞因子如干扰素IFN-γ、白细胞介素IL-2等可以调节免疫反应,执行不同等抗肿瘤功能。

 

常见的体外杀伤效果评价方法有T细胞的增殖检测、杀伤实验(检测靶细胞的裂解程度)、细胞因子检测等。流式细胞术是定量检测各细胞亚群的有效方法之一,细胞计数试剂(Cell Counting Kit-8, CCK-8)、MTT、钙黄素法、实时无标记细胞分析技术(RTCA)也可用于杀伤效果的检测。细胞因子检测常用ELISA、CBA法。

 

CAR-T细胞体内抗肿瘤活性评估

一般CAR-T研究的体内模型会使用肿瘤细胞系异种移植(Cell Line Derived Xenografts, CDX)模型或人源肿瘤异种移植(Patient Derived Xenografts, PDX)模型,进一步研究中也会使用同源移植模型和人免疫系统重建动物模型。CAR-T细胞体内抗肿瘤监测经常会用到活体成像,因此构建Luci-GFP靶细胞使细胞表达绿色荧光蛋白,是常用的方法之一。

 

接种靶细胞构建肿瘤动物模型后,再进行CAR-T细胞的回输,接下来进行下游的评价实验。图6列出了构建肿瘤模型常用的免疫缺陷小鼠、成瘤方式以及CAR-T细胞的回输方式。不同的成瘤方式适用于不同机制研究,比如肿瘤的转移等,皮下成瘤可以直接观察和测量肿瘤的大小,原位接种则可以模拟肿瘤发生的真实环境。

图6. CAR-T细胞体内功能评价。

 

体内评价主要围绕肿瘤生长监测、小鼠生存状态以及毒性检测等进行。小动物活体成像是最常用的检测手段之一,可以直观反映肿瘤细胞在体内的生长情况。同时,体内平均荧光强度(Mean Fluorescence Intensity, MFI)也是评价肿瘤生长的指标之一。定期监控小动物的体重、毛发变化情况、生存期,以及体内T细胞亚群的增殖状态等,可以评估CAR-T细胞回输对动物机体的影响。

 

除此之外,病理学检测如免疫组化或H&E染色可以从不同维度反映CAR-T细胞、肿瘤细胞的浸润程度,或者是脏器组织的病理学变化等。

 

赛业生物细胞治疗一站式解决方案

赛业生物基于多年在肿瘤免疫领域的研究经验,可为CAR-T及其它细胞治疗研究者提供从CAR病毒制备、肿瘤免疫细胞与动物模型的构建,到体外体内药效评价的全流程服务,更好地加速CAR-T及细胞治疗研发进程。

 

参考文献:

[1]Li, C., Mei, H., & Hu, Y. (2020). Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR T-cell therapy. Briefings in functional genomics, 19(3), 175-182.

[2]Banerjee, S., Parasramka, M. A., & Paruthy, S. B. (2018). Garcinol: Preclinical Perspective Underpinning Chemo-and Radiosensitization of Cancer. In Role of Nutraceuticals in Cancer Chemosensitization (pp. 297-324). Academic Press.

[3]Wei, J., Guo, Y., Wang, Y., Wu, Z., Bo, J., Zhang, B., ... & Han, W. (2021). Clinical development of CAR T cell therapy in China: 2020 update. Cellular & molecular immunology, 18(4), 792-804.

[4]Larson, R. C., & Maus, M. V. (2021). Recent advances and discoveries in the mechanisms and functions of CAR T cells. Nature Reviews Cancer, 21(3), 145-161.

[5]Singh, A. K., & McGuirk, J. P. (2020). CAR T cells: continuation in a revolution of immunotherapy. The Lancet Oncology, 21(3), e168-e178.

 

关于赛业

赛业生物科技集团是一家基于模式动物药物研发的国际化创新性CRO平台。依托于品系丰富的基因编辑小鼠资源库、高效且智能化的模式动物定制平台、药物筛选评价小鼠模型平台、一站式小动物表型分析平台、一站式无菌鼠技术服务平台及先进的细胞技术服务平台,建立了多位一体的创新性CRO平台服务网络,以服务于肿瘤、免疫、代谢、内分泌、心血管、神经及传染病等方向的科学研究及药物研发筛选,并与全球100多个国家和地区的数万名科学家及企事业单位建立了广泛的合作,产品与技术已直接应用于包括CNS(Cell, Nature, Science)三大期刊在内的6200余篇学术论文。赛业生物已获得ISO9001:2015和AAALAC双认证,确保向广大专家学者提供的所有产品和技术服务符合国际标准的同时也表达了我们尊重动物福利和伦理,重视生物安全的负责任态度。 如有需要,欢迎联系我们咨询。

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