CAR-T细胞治疗的研究路线分析

嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T细胞疗法在白血病和淋巴癌的治疗中已经取得了长足的进展。2012年，罹患急性淋巴细胞白血病的7岁女孩Emily Whitehead接受了全球首例CAR-T疗法的临床实验，被成功治愈；2017年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了全球首个CAR-T疗法，使这一领域进入了创新研究的快速发展期；2021年，国内两款CAR-T药物先后获批上市，售价为120万-129万元一针，在国内引起广泛的关注。

本文将为大家带来CAR-T细胞治疗研究路线的解析，讨论各阶段在 CAR-T 细胞疗法研究中的重要作用。

图1. Emily Whitehead，全球首位接受CAR-T治疗且被成功治愈的白血病患者，目前已经无癌生存9年。

图源：https://emilywhiteheadfoundation.org

CAR-T细胞疗法需要从患者身上抽取血液并分离出T细胞，对T细胞进行活化并通过细胞转染（通常为病毒转染，CRISPR/Cas等技术也有报道^[1]），使其在表面表达嵌合抗原受体（CAR），以特异性识别肿瘤抗原。接下来，将CAR-T细胞扩增并回输至患者体内，达到治疗癌症的目的。

图源：https://www.malaghan.org.nz/

表1. 已经上市的CAR-T产品列表

肿瘤抗原的分类有三种：

（1）细胞谱系抗原，这种抗原在特定的细胞谱系中表达，如B细胞谱系抗原CD19、CD20等；

（2）肿瘤特异性抗原，这种抗原仅在肿瘤细胞上表达，特异性高，是最理想的治疗靶点；

（3）肿瘤相关抗原，在肿瘤细胞和组织中高表达，但在正常组织中有限表达，这类抗原是目前研究得最多的一类抗原。

为了使CAR-T细胞特异性攻击癌细胞而不攻击自身正常的细胞和组织，因此靶点选择的标准是：肿瘤细胞和组织高表达；正常组织不表达或者低表达。

因为实体瘤微环境等因素对CAR-T疗效的制约，CAR-T细胞治疗的研究常被分为血液瘤和实体瘤两部分。目前上市的7种CAR-T药物均是针对血液瘤的靶点，而血液恶性肿瘤仅占所有恶性肿瘤的10%左右^[2]。由此可见，血液瘤和实体瘤的CAR-T研究难易度差异巨大。血液瘤研究中最常用的靶点是CD19，针对白血病和淋巴癌；其次是BCMA，用于多发性骨髓瘤的治疗研究。实体瘤中常研究的靶点有间皮素（Mesothelin）、MUC1和GPC3等。

图3. CAR-T临床试验中各类靶点的试验数量^[3]。上：血液瘤中靶点的研究；下：实体瘤中靶点的研究。

特异性免疫是人体抵抗病原体攻击的第三道防线：病原体侵入人体后，刺激淋巴细胞产生抗体，引起一系列的免疫反应。科学家将抗体特异性识别抗原的特性，与T细胞受体（T Cell Receptor, TCR）活化T细胞的特性结合起来，这就是CAR分子设计的基本原理。

目前科学研究中已经定义了4代CAR分子结构：

（1）第一代CAR分子由三部分组成，第一部分是来自抗体的抗原识别单链可变区（scFv），第二部分是跨膜区，第三部分则是来自内源性TCR的细胞内信号结构域CD3ζ分子；

（2）第二代CAR分子在第一代的基础上增加了共刺激结构域，共刺激结构域在跨膜区和信号结构域CD3ζ分子之间，不同的共刺激结构域会使CAR-T细胞向不同的方向活化。目前FDA批准的CAR-T产品都是第二代设计，带有CD28或4-1BB共刺激结构域；

（3）同时包含两种共刺激结构的CAR分子，则被称为第三代CAR；

（4）第四代CAR增加了增强T细胞功能的修饰，比如使T细胞产生额外的蛋白质（如细胞因子）或拥有额外的受体等。

图4. 1-4代CAR分子结构示意图^[5]

CAR分子构建可以在各代CAR结构的基础上进行调整和优化，例如：

（1）scFv的选择：scFv选择的重点是特异性，如果和靶点外的蛋白有交叉反应，则出现脱靶效应的概率会比较大。一般来说， CAR分子需要合适的亲和力，太高或者太低都会影响CAR-T细胞的效果，所以需要进一步设计实验筛选出具有合适亲和力的CAR分子；

（2）连接基团（Linker）的优化： Linker是连接scFv的重链（VH）和轻链（VL）的区域，Linker通常来自于重复的甘氨酸和丝氨酸残基^[4]，因此它的长度上面还有可优化的空间；

（3）铰链区Hinge的选择：铰链区（Hinge）连接着识别抗原的胞外域和跨膜区，它影响胞外域和细胞膜的空间位置，该区域需要具备一定的灵活性来允许scFv结合抗原；

（4）共刺激结构域的选择：不同的共刺激分子具备不同的特性，表2翻译自诺华官网，列举了两种常见的共刺激结构域4-1BB和CD28的不同之处。

表2. 共刺激结构域4-1BB和CD28的功能。

T细胞的活化和扩增，CAR-T细胞的构建和稳转细胞株构建类似。然而， T细胞一般处于静息状态，需要先对T细胞进行活化激活。CAR分子和载体设计好后，就可以开始进行CAR-T细胞的构建。

慢病毒转染，由于免疫细胞的特殊性，对T细胞进行慢病毒转导所需的病毒纯度要高于普通稳转株。CAR-T细胞的一般构建方式是：首先将外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)进行分离和活化。1-2天后用慢病毒转导，后期进行CAR-T细胞的扩增和鉴定。

图5. CAR-T细胞构建流程。

CAR-T细胞体外杀伤实验通常是将CAR-T细胞和靶细胞共孵育，然后进行一系列的评估。靶细胞有两种来源，一类是天然表达抗原的肿瘤细胞系，还有一类是人为构建的表达抗原阳性的稳转细胞株。人为构建稳转株的主要方式是慢病毒法，构建好病毒载体后，转染细胞（如293T细胞），使细胞正常表达或者过表达抗原。

CAR分子识别抗原后，会释放 T 细胞效应反应，包括增殖、细胞因子释放、代谢改变和细胞毒性等。CAR-T 细胞被认为主要通过分泌颗粒酶和穿孔素发挥其细胞毒性的功能^[4]。细胞因子如干扰素IFN-γ、白细胞介素IL-2等可以调节免疫反应，执行不同等抗肿瘤功能。

常见的体外杀伤效果评价方法有T细胞的增殖检测、杀伤实验（检测靶细胞的裂解程度）、细胞因子检测等。流式细胞术是定量检测各细胞亚群的有效方法之一，细胞计数试剂（Cell Counting Kit-8, CCK-8）、MTT、钙黄素法、实时无标记细胞分析技术（RTCA）也可用于杀伤效果的检测。细胞因子检测常用ELISA、CBA法。

一般CAR-T研究的体内模型会使用肿瘤细胞系异种移植（Cell Line Derived Xenografts, CDX）模型或人源肿瘤异种移植（Patient Derived Xenografts, PDX）模型，进一步研究中也会使用同源移植模型和人免疫系统重建动物模型。CAR-T细胞体内抗肿瘤监测经常会用到活体成像，因此构建Luci-GFP靶细胞使细胞表达绿色荧光蛋白，是常用的方法之一。

接种靶细胞构建肿瘤动物模型后，再进行CAR-T细胞的回输，接下来进行下游的评价实验。图6列出了构建肿瘤模型常用的免疫缺陷小鼠、成瘤方式以及CAR-T细胞的回输方式。不同的成瘤方式适用于不同机制研究，比如肿瘤的转移等，皮下成瘤可以直接观察和测量肿瘤的大小，原位接种则可以模拟肿瘤发生的真实环境。

体内评价主要围绕肿瘤生长监测、小鼠生存状态以及毒性检测等进行。小动物活体成像是最常用的检测手段之一，可以直观反映肿瘤细胞在体内的生长情况。同时，体内平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity, MFI）也是评价肿瘤生长的指标之一。定期监控小动物的体重、毛发变化情况、生存期，以及体内T细胞亚群的增殖状态等，可以评估CAR-T细胞回输对动物机体的影响。

除此之外，病理学检测如免疫组化或H&E染色可以从不同维度反映CAR-T细胞、肿瘤细胞的浸润程度，或者是脏器组织的病理学变化等。

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