白血病治疗热门靶点-Flt3基因【每周一鼠】

Flt3基因

该基因编码调节造血功能的III类受体酪氨酸激酶。该受体通过fms相关的酪氨酸激酶3配体与细胞外结构域结合而被激活，从而诱导质膜中同型二聚体的形成，导致受体的自磷酸化。活化的受体激酶随后磷酸化并激活涉及骨髓中造血细胞凋亡、增殖和分化的途径中的多个细胞质效应分子。与该基因相关的疾病有白血病、急性髓细胞性白血病。其相关通路包括ERK信号通路和药代动力学相关信号通路。

图1. Flt3 蛋白结构^【6】。

Flt3基因与白血病

研究表明，Flt3基因相关疾病有白血病和急性髓细胞性白血病。白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。该病的致病因素有病毒因素（RNA病毒）、化学因素（苯及其衍生物、亚硝胺类物质、保泰松及其衍生物与氯霉素等）、放射因素（钴-60）和遗传因素（染色体畸变）等。

该病的发病机制多为骨髓和其他造血组织中克隆性白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等，导致克隆性白血病细胞浸润其他非造血组织和器官，抑制正常造血功能。此病的临床症状多为贫血、出血、感染发热、骨骼疼痛与肝、脾、淋巴结肿大。

急性髓性白血病属于白血病的一种，该病是一种高度依赖于骨髓微环境的破坏性疾病，高度依赖于线粒体氧化磷酸化系统生成ATP，也称为骨髓生态位。此病的常用治疗方法有化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗与干细胞移植等，常用治疗药物有 Ara-C、依托泊苷和阿霉素等，此外相关研究亦表明，二甲双胍对减少化疗敏感性方面有潜在价值^【1~3】。

Flt3基因编辑小鼠

Bailey E等人研究表明，Flt3基因的突变会引发急性髓性白血病^【4】。该病最常见的Flt3突变是近膜结构域的内部串联重复(ITD)突变(23%)和酪氨酸激酶结构域的点突变(10%)。研究人员将酪氨酸（FLT3/D835Y）取代第838位天冬氨酸（相当于第835位人天冬氨酸残基）生成FLT3/D835Y突变小鼠，与FLT3/ITD突变小鼠比较发现，FLT3/D835Y小鼠存活时间更长。

12周龄时，杂合FLT3/D835Y小鼠脾肿大，但与FLT3/ITD小鼠相比肿大程度较轻；FLT3/D835Y和FLT3/ITD小鼠骨髓（BM）的 Mac1⁺、Gr1⁺与Mac1⁺ /Gr⁺的细胞比例均高于WT小鼠。比较3月龄和12月龄小鼠BM和脾脏组织学发现，FLT3/D835Y和FLT3/ITD小鼠BM和脾脏组织结构破坏、细胞扩张；与FLT3/ITD小鼠相比，FLT3/D835Y小鼠病变较轻。与FLT3/ITD小鼠相比，FLT3/D835Y小鼠的骨髓增生性肿瘤侵袭性较低，并且在B细胞发育中的阻滞作用较小（图 2）。

图2. Flt3基因突变表型^【4】。

图注：(A):与野生型和FLT3/ITD小鼠相比，12周大的FLT3/D835Y小鼠脾脏大小适中。(B)12周龄野生型、FLT3/D835Y和FLT3/ITD小鼠BM中Mac1和Gr1表达的代表性FACS分析和图形表示。(C)3个月和12个月时所有三种基因型的BM和脾脏的H&E染色（比例尺，100μm）。（D）使用12周龄小鼠BM的B淋巴细胞相关标志物进行免疫表型分析。（E）B细胞发育不同阶段细胞频率的图形表示，如D中评估，数据代表3个单独的实验（每个实验n=3）。（F）通过定量RT-PCR评估的所有三种小鼠的B220⁺CD43⁺CD19 细胞中的转录因子的表达水平。数据表示为平均值±SEM ;图上的P值：NS，P＞0.05；*P＜0.05；**P＜0.001.

Zriwil A等人通过在Flt3基因15号外显子插入loxP-Neo-loxP，通过与Mx1^cre/+交配产生淋巴髓系祖细胞Flt3敲除小鼠^【5】。

Mx1^cre/+ Flt3^fl/fl和Mx1^+/+ Flt3^fl/fl小鼠在7周时腹膜内注射300μg 多聚胞苷酸 (pIpC)5次，间隔两天。在注射后4周对小鼠进行分析。在pIpC处理后，Mx1^cre/+ Flt3^fl/fl小鼠Lin−SCA-1⁺KIT⁺细胞和淋巴祖细胞（CLP）上的Flt3几乎丧失，造血干细胞（HSC）数量（Lin - SCA-1⁺ KIT⁺ CD48- CD150⁺）显著降低，早期胸腺祖细胞（ETP）（Lin - CD4 - CD8a - KIT⁺ CD25 -）细胞显著低于Mx1^+/+ Flt3^fl/fl小鼠（图 3）。

图3. Flt3基因敲除表型^【5】。

(A)：注射多聚肌醇聚胞苷酸 (pIpC) 后4周，Mx1^cre/+ Flt3^fl/fl小鼠和Mx1^+/+ Flt3^fl/fl小鼠的Lin-SCA-1⁺KIT⁺细胞和Lin-SCA-1^lowKIT^low细胞上FLT3表达（n=6~8）。(B-C) (B)：骨髓中LT-HSC、CD48-CD150-ST-HSC、CD48⁺ CD150- MPP、CLP所占百分比。(C)：骨髓中ProB细胞(Lin-B220⁺CD43⁺CD19⁺CD24⁺CD93⁺)、PreB细胞(Lin-B220⁺CD43^-CD19⁺IgM-)和IgM⁺ B所占百分比。(D)：早期胸腺祖细胞 (ETP) (Lin-CD4^-CD8a^-KIT ⁺CD25^-)、DN2 (Lin-CD4^-CD8a^- KIT⁺ CD25⁺)和DN3 (Lin- CD4^-CD8a^- KIT^-CD25⁺) 的平均百分比。(E)：pIpC 注射后4周，Mx1^+/+ Flt3^fl/fl和 Mx1^cre/+ Flt3^fl/fl小鼠的鉴定分析。上条带代表缺失的Flt3等位基因(461bp)，中条带代表floxed Flt3等位基因(282bp)，下条带代表WT等位基因(205bp)。(F-H) CD45.2细胞中(F):LT-HSCs、CD48⁺CD150^- MPPs 和 CLPs、(G): ProB细胞、PreB细胞和 IgM+B细胞在BM，(H) ETP/DN 1、DN2和DN3细胞 (n =6）所占百分比。*P<0·05；**P<0·01；***P< 0·001。

小结

小鼠Flt3基因功能丧失相关的白血病具有潜在的研究价值，该基因突变可用于白血病和急性髓细胞性白血病发病机制的深入探讨，同时可用于此类疾病治疗新方法的研发。

1. Shafat MS, Oellerich T, Mohr S, Robinson SD, Edwards DR, Marlein CR, Piddock RE, Fenech M, Zaitseva L, Abdul-Aziz A, Turner J, Watkins JA, Lawes M, Bowles KM, Rushworth SA. Leukemic blasts program bone marrow adipocytes to generate a protumoral microenvironment. Blood. 2017 Mar 9;129(10):1320-1332. doi: 10.1182/blood-2016-08-734798. Epub 2017 Jan 3. PMID: 28049638.

2. You R, Wang B, Chen P, Zheng X, Hou D, Wang X, Zhang B, Chen L, Li D, Lin X, Huang H. Metformin sensitizes AML cells to chemotherapy through blocking mitochondrial transfer from stromal cells to AML cells. Cancer Lett. 2022 Feb 2;532:215582. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215582. Epub ahead of print. PMID: 35122876.

3. Basak NP, Banerjee S. Mitochondrial dependency in progression of acute myeloid leukemia. Mitochondrion. 2015 Mar;21:41-8. doi: 10.1016/j.mito.2015.01.006. Epub 2015 Jan 29. PMID: 25640960.

4. Bailey E, Li L, Duffield AS, Ma HS, Huso DL, Small D. FLT3/D835Y mutation knock-in mice display less aggressive disease compared with FLT3/internal tandem duplication (ITD) mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Dec 24;110(52):21113-8. doi: 10.1073/pnas.1310559110. Epub 2013 Nov 19. PMID: 24255108; PMCID: PMC3876267.

5. Zriwil A, Böiers C, Kristiansen TA, Wittmann L, Yuan J, Nerlov C, Sitnicka E, Jacobsen SEW. Direct role of FLT3 in regulation of early lymphoid progenitors. Br J Haematol. 2018 Nov;183(4):588-600. doi: 10.1111/bjh.15578. Epub 2018 Sep 14. PMID: 30596405; PMCID: PMC6492191.