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澳门科技大学刘良及黄锦伟团队揭示了类风湿性关节炎发病的新机制

2020年2月,澳门科技大学刘良及黄锦伟团队在Cellular & Molecular Immunology发表了题为“Sirtuin 5 deficiency increases disease severity in rats with adjuvant-induced arthritis”的文章。借助一系列关节炎动物的验证实验,揭示了类风湿性关节炎发病的新机制,开启了启动SIRT5基因或增强糖代谢治疗类风关的新策略以及为研发精准治疗类风关的靶向新药开辟了新路径。

类风湿性关节炎发病的新机制

研究背景

类风湿关节炎(简称类风关)是世界性顽疾,其发病原因与机体免疫功能失调有关,但其确切的发病机制仍未明了。近年来,从基因调控入手研究类风关的精准发病机制和治疗靶点是国际风湿免疫领域的研究热点。

 

研究团队新近研究发现,类风关患者血中的去琥珀酰化酶sirtuin 5(SIRT5)较健康人明显降低,这提示机体SIRT5水平与类风关的发病机制相关联。基于这一新发现,研究团队巧妙地设计了一系列关节炎动物实验予以验证并取得了以下成果:

(1)建立SD大鼠佐剂性关节炎(AIA)模型,证实了模型大鼠血清中的SIRT5浓度较正常的大鼠明显降低,与临床类风关患者的血清检测结果相一致;

 

(2)首创腺病毒介导SIRT5基因高表达的SD大鼠AIA模型,发现其关节炎程度较非SIRT5基因高表达大鼠明显减轻,说明促进SIRT5基因高表达能够显著减轻关节炎的病理程度;

 

(3)采用CRISPR/Cas技术,创立了世界上首个SIRT5基因敲除的SD大鼠AIA模型,发现SIRT5基因敲除可显著加重关节炎程度。

 

研究材料

该研究使用的细胞是类风湿性关节炎病人滑膜组织来源的原代细胞RASFs和健康人外周血来源的CD14+-CD16-单核细胞以及临床样本包括健康人和类风关病人外周血的单个核细胞;动物实验部分使用的是野生型的雄性SD大鼠和Situin5基因敲除的SD大鼠(本实验所用Situin5基因敲除SD大鼠由赛业生物提供)

 

技术方法

该研究通过对细胞的培养使用了基因质粒介导的过表达,shRNA介导的基因沉默, 流式细胞术, QPCR, Western blot, ELISA, 免疫共沉淀(Co-IP), 腺病毒介导的组织过表达,CRSPR-Cas基因编辑技术以及Micro-CT仪等方法对动物组织样本进行了一系列研究。

 

技术路线

类风湿性关节炎发病的新机制

 

研究结果

该研究首先通过RTPCR和Western blot 技术验证Sirtuin 5基因和蛋白在RA病人和AIA大鼠滑膜组织中的表达情况。结果发现,和健康人或正常大鼠组相比,Sirtuin 5基因和蛋白在RA病人样本和AIA大鼠滑膜组织中的表达均显著降低。

类风湿性关节炎发病的新机制

类风湿性关节炎发病的新机制

                                                                                      A

 

类风湿性关节炎发病的新机制
类风湿性关节炎发病的新机制
                                                                                       B

图1:在RA病人外周血 (A) 和AIA大鼠滑膜组织 (B) SIRT5 mRNA和蛋白的表达情况。

其次,在RASFs细胞中,和对照组比较,MTX给药组可显著增加SIRT5蛋白表达。当加SIRT抑制劑Suramin后,SIRT5的表达会被逆转呈降低趋势。同时,当加入各种炎症因子刺激后,SIRT5的mRNA和蛋白的表达均被显著抑制。同时,在CD14+-CD16-单核细胞中过表达SIRT5基因后,在LPS的刺激下,促炎因子如IL-6和TNF-α的表达明显低于空白质粒对照组。同时,当沉默SIRT5基因后,在LPS的刺激下,IL-β的表达明显高于空白对照组。

类风湿性关节炎发病的新机制

                                                                                    A
类风湿性关节炎发病的新机制

                                                                                    B

类风湿性关节炎发病的新机制
                                                                                   C

图2:SIRT5在RASFs和CD14+-CD16-单核细胞中对促炎细胞因子产生的影响 (A) SIRT5及其抑制剂suramin对RASFs中促炎细胞因子产生的影响。(B) LPS和TNF-α刺激对RASFs细胞中SIRT5产生的影响。(C) 在CD14+-CD16-单核细胞中过表达或沉默SIRT5基因后对促炎因子如IL-β,IL-6和TNF-α产生的影响。

 

最后,在体内实验中发现,和腺病毒对照组比较,腺病毒介导的过表达SIRT5可显著抑制AIA大鼠的关节炎和骨破坏并呈剂量依赖性。而SIRT5腺病毒失活对照组可显著加剧骨关节的破坏。同时,在AIA大鼠模型中,由CRISPR-Cas 介导的SIRT5基因缺失后会显著增加关节炎症和骨破坏。当给予AIA大鼠糖代谢产物丙酮酸乙酯后,SIRT5基因敲除的AIA大鼠关节肿胀可显著缓解。

类风湿性关节炎发病的新机制

A

类风湿性关节炎发病的新机制

B

图3: SIRT5基因缺失使关节炎程度明显加重。(A) 由腺病毒介导的AIA大鼠过表达SIRT5后,大鼠的骨关节破坏明显减轻且呈剂量依赖性。(B) 给AIA大鼠补充糖代谢产物丙酮酸乙酯后,SIRT5基因敲除的AIA大鼠关节肿胀显著缓解。

 

总结

结合上述临床和实验研究结果,研究人员证实SIRT5基因的低表达可促进类风关疾病的进展。为进一步明确SIRT5调控类风关发生发展的作用机理,团队着眼于免疫代谢开展了深入研究,发现AIA大鼠SIRT5表达水平与血中单核/巨噬细胞数量及大鼠关节滑膜成纤维细胞数量成反比;给AIA大鼠补充糖代谢产物丙酮酸乙酯后,SIRT5基因敲除AIA大鼠关节肿胀显著缓解(图3)。这些发现揭示了类风湿性关节炎发病的新机制,开启了启动SIRT5基因或增强糖代谢治疗类风关的新策略以及为研发精准治疗类风关的靶向新药开辟了新路径。

类风湿性关节炎发病的新机制

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Reference

Zhang, N., Zhang, H., Law, B.Y.K. et al. Sirtuin 5 deficiency increases disease severity in rats with adjuvant-induced arthritis. Cell Mol Immunol 17, 1190–1192 (2020). https://doi.org/10.1038/s41423-020-0380-4

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