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中山大学中山眼科中心刘春巧教授团队揭示光感受器外段蛋白转运新机制

2022年4月10日,中山大学中山眼科中心刘春巧和刘奕志课题组联合在美国科学院院刊PNAS上发表研究论文“Tmem138 is localized to the connecting cilium essential for rhodopsin localization and outer segment biogenesis”。该研究首次揭示神经视网膜光感受器纤毛膜蛋白复合体在光感分子视紫红质(Rhodopsin)和其他外段蛋白运输及外段形态发生过程中的重要作用从而为色素视网膜炎(Retinitis Pigmentosa,RP)的病理分子机制提供了必要补充。该项研究同时对纤毛病变引起的中枢神经系统脑水肿的分子机制提供了重要的参考。

光感受器外段蛋白转运新机制

研究背景

视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa,RP)是导致失明,影响人类生活质量的重要神经类型疾病。其中遗传性RP世界范围的发病率约为1:4000,影响我国近三十几万人口,目前缺乏有效的治疗手段。RP的本质是光感受器坏死,视网膜的光感受器(Photoreceptor)分为两类,分别是负责暗视野的视杆细胞(Rod)和明视野的视锥细胞(Cone)。Rod数量约占视网膜95%,绝大部分RP由Rod的坏死引起,导致管状视野(Tunnel vision),并最终失明。

 

许多RP与负责光感受器外段蛋白运输的基因突变密切相关。外段蛋白运输失败会导致其在内段堆积,使光感受器出现应激性细胞坏死。光感受器在结构上分为外段(Outer segment,OS)、连接纤毛(Connecting cilium,CC)和内段(Inner segment,IS)。OS的膜盘结构是光信号级联传导的场所,每天更新约10%,但其本身不具有蛋白和脂类的合成能力。光信号通路蛋白元件需要在IS合成经狭窄的CC纤毛桥运输至OS以维持其更新速度。尽管已有很多关于纤毛在光感受器外段蛋白运输中的功能研究,但这些研究大针对纤毛的微管及相关的结构蛋白,动力蛋白(motors)和囊泡运输复合体(IFT)的研究,而关于纤毛膜蛋白在光感受器外段蛋白的运输作用的研究尚为空白。

 

研究材料

体内实验:通过基因打靶技术构建lox小鼠,通过与Sox2-cre小鼠的杂交得到Tmem138全身性敲除小鼠。(本实验所用Tmem138基因敲除小鼠模型由赛业生物提供)。

 

体外实验:体外培养293T细胞进行Tmem138互作实验。

 

技术方法

01.通过电生理(ERG)及OCT(光学相干断层扫描)视网膜成像技术对不同时期的 Tmem138基因敲除小鼠视网膜的功能及结构进行活体检测。

02.通过HE染色,透射电镜,免疫电镜,扫描电镜的方法对Tmem138基因敲除小鼠视网膜进行组织学及超微结构分析。

03.通过免疫荧光共标检测Tmem138及OS蛋白在视网膜中的定位。

04.通过免疫共沉淀与体内视网膜组织pull down实验寻找Tmem138蛋白的互作蛋白。

 

技术路线

光感受器外段蛋白转运新机制

 

研究结果

1. Tmem138基因敲除小鼠模型的构建及表型分析

刘春巧课题组一直关注神经视网膜的发育和遗传疾病的研究。前期对调控纤毛发育和细胞极性运输的Wnt/PCP信号通路进行了研究(Guo et al., 2018; IOVS and EXP EYE RES; Guo et al., 2020, IOVS and Development)并发现了几个受Prickle1调节的跨膜蛋白。其中TMEM138突变会引起Joubert综合症并伴随视网膜营养不良。为了研究TMEM138突变引发视网膜疾病的分子机理,作者首先构建了具有Joubert综合症表型的Tmem138基因敲除小鼠模型(Tmem138基因敲除小鼠模型由赛业生物有限公司提供),该品系小鼠具有脑室扩张,精子发生障碍及视网膜退行性变性等与Joubert病人相似的表型(图1)。

光感受器外段蛋白转运新机制

图1:Tmem138缺失导致脑室扩张,精子缺失症以及视网膜退行性疾病

 

2. Tmem138膜蛋白在光感受器细胞的定位分析

接下来,作者通过多重免疫荧光的分子标记,区分纤毛外段的不同区域,并通过基因敲除小鼠验证,确立了Tmem138定位于连接纤毛的近端(图2)。

光感受器外段蛋白转运新机制

图2:Tmem138定位于连接纤毛

 

3. Tmem138基因敲除导致纤毛胞质蛋白Ahi1在CC远端缺失

因为Tmem138定位于连接纤毛,作者探究了光感受器纤毛组分是否发生改变,作者分别检测了纤毛基体(Cep164),连接纤毛(Ahi1),轴丝(Rp1)以及IFT蛋白运输组分(Ift88,Kif3A)变化,发现Tmem138缺失后能导致OS发育早期(P5)连接纤毛蛋白Ahi1的显著改变(图3)。

光感受器外段蛋白转运新机制

图3:Tmem138缺失导致连接纤毛Ahi结构改变

 

4. Tmem138缺失未导致纤毛结构性改变

接着,作者继续探究了Ahi1纤毛蛋白的改变是否是由于其纤毛结构破坏所致,扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)的结果显示Tmem138缺失后光感受器纤毛结构未发生明显变化(图4)。

光感受器外段蛋白转运新机制

图4:SEM和TEM显示光感受器纤毛结构

 

5. Tmem138基因敲除小鼠表现出早发且快速的视网膜退化

为了进一步了解Tmem138在OS生物发生中的作用,作者检测了光感受器从P3到P14发育过程中视紫红质的表达和定位,发现Tmem138敲除后视紫红质最早从第5天开始在内段堆积(图5)。

光感受器外段蛋白转运新机制

图5:Tmem138缺失导致光感受器外段发育异常

 

6. Tmem138/Tmem231/Ahi1纤毛复合体介导Rhodopsin跨纤毛运输

作者继续探究了Tmem138介导光感受器外段发生的机制,通过免疫共沉淀和视网膜pull down实验,作者发现Tmem138可以与两个JBTS蛋白(Ahi1和Tmem231)以及视紫红质相互作用。因此作者做了一个假设的模型:即位于连接纤毛膜基部的Tmem138形成Tmem138/Tmem231/Ahi1复合体对CC部位分子组装至关重要,这种Tmem138复合体与视紫红质相互作用,以促进其在不同马达蛋白驱动下沿者微管或微丝结构进行运输。Tmem138的缺失可导致Ahi1和Tmem231定位错误,最终阻碍了视紫红质以及其他OS蛋白通过CC(图6)。 

光感受器外段蛋白转运新机制

总结

该研究首次揭示神经视网膜光感受器纤毛膜蛋白复合体在视紫红质和其他外段蛋白运输中起到的重要作用,从而为RP的病理分子机制提供了必要补充。该项研究同时对纤毛病变引起的中枢神经系统脑水肿的分子机制提供了重要的参考。

 

补充说明

该项目研究得到了国家自然科学基金,广州市科技创新项目及中山大学百人计划的支持。中山大学中山眼科中心、眼科学国家重点实验室为第一单位。郭佃磊博士后和汝佳丽博士是本论文的第一作者,刘春巧研究员和刘奕志教授是本论文通讯作者。

 

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