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Ⅱ型糖尿病治疗新方向——华南农业大学研究团队揭示α酮戊二酸调控肝糖代谢的分子机制

2型糖尿病（T2DM）是一个日益严重的全球性疾病，它通过引起相关代谢性疾病增加死亡率。前期研究表明，运动可以通过诱导肌肉产生一些代谢产物改善葡萄糖稳态，这些肌肉来源的代谢物是T2DM潜在的治疗靶点，而肌肉代谢物对T2DM作用的具体机制仍缺乏研究。α-酮戊二酸（αketoglutarate acid, AKG）是三羧酸循环中重要的代谢物质，也是肌肉主要的代谢物之一，它已被证明在各种生物过程中发挥重要作用，包括肠道免疫、抗氧化作用、表观遗传修饰和抗癌等，但AKG是否在T2DM治疗中发挥作用以及具体作用机制仍不清楚。

2022年5月4日，华南农业大学动物科学学院江青艳教授和束刚教授课题组以岭南现代农业科学与技术广东省实验室/广东省动物营养调控重点实验室为第一单位，在国际主流学术期刊Science Advances（综合1区，IF3 years=14.116）在线发表了题为“α-Ketoglutaric acid ameliorates hyperglycemia in diabetes by inhibiting hepatic gluconeogenesis via serpina1e signaling”的研究论文，初步揭示了α-酮戊二酸调控动物肝脏糖代谢的分子机制。该论文的通讯作者为束刚教授和江青艳教授，第一作者为华南农业大学博士后袁业现、华南农业大学朱灿俊副教授和西北农林科技大学王永亮副教授。

肝脏是营养物质代谢转化的枢纽。肝脏中的糖脂代谢反应不仅与人类肥胖和糖尿病等疾病密切相关，而且还直接决定了畜禽营养物质的利用效率。本文研究发现α-酮戊二酸主要抑制肝脏糖异生，降低生糖氨基酸向葡萄糖的转化。运用转录组学、表观遗传学和葡萄糖钳夹等技术研究还发现，α-酮戊二酸主要通过JMJD3抑制serpina1e基因启动子区域H3K27甲基化水平，进而促进serpina1e基因表达，调控肝脏糖异生关键酶表达和活性。该研究对于采用代谢中间产物调控畜禽能量摄入、营养素代谢和饲料利用效率具有重要的参考价值，同时也对临床代谢相关疾病的营养干预方案提供借鉴。

研究材料

体内试验：通过在Alb-cre小鼠肝脏内导入靶向serpina1e基因的sgRNA病毒和过表达病毒，构建serpina1e基因的靶向敲除或者过表达模型，研究serpina1e在肝脏糖异生中的作用。（本试验所用sgRNA干扰AAV病毒和过表达AAV病毒均由赛业生物提供）

体外试验：体外通过培养小鼠肝脏原代细胞和肝片组织，研究AKG对糖异生的影响。

技术方法

本文所用技术方法包括：肝脏转录组学、葡萄糖钳夹技术、免疫组化、WB/qPCR、ELISA、HBAAV-sgRNA病毒构建等。

技术路线

研究结果

1.血液中AKG含量与糖化血红蛋白HbA1c的关系

课题组研究发现，血液中AKG浓度与糖化血红蛋白HbA1c含量表现出明显负相关关系，（HbA1c，R=-0.84，P<0.0001）。我们进一步发现非糖尿病肥胖小鼠血浆中AKG水平显着高于糖尿病肥胖小鼠的水平，这表明AKG在血糖控制中的潜在作用。此外，我们发现AKG浓度与人血液中的HbA1c水平表现出相似的负相关关系（R=-0.39，P<0.001）。相反，AKG相关代谢物的浓度与人血浆中的HbA1c水平呈正相关。这些结果表明，血液AKG与血糖呈负相关，表明其在血糖调控中具有重要生理作用。

图1 血液中AKG含量与血糖的关联分析

2.饮水添加AKG对DIO小鼠糖代谢相关指标的影响

为研究AKG降低血糖的机制，试验检测了糖代谢的一些指标。结果发现，饮水添加AKG能显著增加小鼠血清中胰岛素的含量，对葡萄糖耐受（GTT）和胰岛素敏感性（ITT）无影响，但显著改善丙酮酸耐受，这提示AKG降低血糖的效应可能与糖异生有关。为此，试验进一步测定了糖异生相关指标。结果发现，AKG处理能显著降低了肝脏糖异生限速酶的mRNA表达以及蛋白表达。同时，饮水添加AKG还能显著降低了PEPCK，G6Pase和FBP的酶活性。此外，试验利用高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术检测了糖代谢的指标。以上结果提示AKG可能通过抑制肝糖异生和刺激胰岛素分泌来降低小鼠血糖。

Ⅱ型糖尿病治疗新方向

图2 饮水添加AKG对DIO小鼠血糖的影响

3.Serpina1e参与AKG调控肝脏糖异生过程

为了研究AKG调控糖异生的机制，研究人员将长期AKG处理的DIO小鼠肝脏做转录组学检测，并发现AKG极显著增加serpina1e（serine peptidase inhibitor, clade A, member 1E）基因的表达，干扰serpina1e有效地逆转了AKG对PA处理的原代肝细胞中PEPCK，G6Pase和FBP活性的抑制作用。为了进一步确定serpina1e在AKG调控糖异生中的作用，研究人员构建了serpina1e肝脏特异性KO小鼠模型（Alb-serpina1e-/-）（试验所用Serpina1e-sgRNA病毒由赛业生物提供）。通过肝脏特异性serpina1e敲除逆转了AKG降低血糖的效应，表明AKG是通过serpina1e抑制肝脏糖异生，从而降低小鼠血糖。

图3 Serpina1e介导AKG调控糖异生途径

4.AKG通过调控serpina1e组蛋白甲基化修饰调控糖异生

试验进一步研究AKG如何调控serpina1e基因表达的。结果发现，AKG增加了原代肝细胞中JMJD3的mRNA表达，而干扰JMJD3逆转了AKG对serpina1e启动子区域H3K27me3甲基化水平以及糖异生酶活性的抑制作用，表明AKG通过抑制serpina1e启动子区域H3K27me3水平促进serpina1e基因的表达，进而抑制肝脏糖异生。同时，AKG促进了原代肝细胞线粒体和细胞核中SLC25A11蛋白的表达，干扰SLC25A11逆转AKG对serpina1e的调控作用，表明AKG可能通过SLC25A11调控细胞内表观遗传修饰过程。

图4 Serpina1e介导AKG表观遗传调控

总结

（1）AKG显著降低DIO小鼠血糖，改善丙酮酸耐受，促进胰岛素分泌，抑制糖异生途径，但对普通日粮饲喂小鼠血糖无影响。

（2）AKG主要通过降低serpina1e启动子区域的H3K27me3水平来促进serpina1e表达，进而抑制糖异生途径。

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参考文献：

Yuan Y, Zhu C, Wang Y, Sun J, Feng J, Ma Z, Li P, Peng W, Yin C, Xu G, Xu P, Jiang Y, Jiang Q, Shu G. α-Ketoglutaric acid ameliorates hyperglycemia in diabetes by inhibiting hepatic gluconeogenesis via serpina1e signaling. Sci Adv. 2022 May 6;8(18):eabn2879.

本试验所用sgRNA干扰AAV病毒和过表达AAV病毒均由赛业生物提供。AAV由于具有良好的组织特异性、低免疫原性及高安全性等优势，是目前基因转导及基因治疗中应用最广泛的递送载体。

赛业生物依据多年病毒包装平台的经验，可以提供不同质量标准的AAV、LV、ADV等病毒。成熟稳定的病毒包装平台，客户多篇文献引用发表，且广泛运用到各种细胞系模型的构建和活体动物的体内研究中。

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