研究因环境化学物质罹患癌症风险的有效手段——Nqo1基因敲除小鼠【每周一鼠】

Nqo1基因是一个蛋白质编码基因，具有种族特异性，人Nqo1位于16q22.1，长为20kb，含6个外显子和5个内含子，编码274个氨基酸的黄素蛋白酶，其广泛分布于绝大多数真核生物细胞胞浆，如上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、胶质细胞、乳腺癌细胞等，是抗氧化损伤和保护细胞的主要因子。在各种环境因素（如缺氧、物质依赖等）刺激下可诱导Nqo1表达，Nqo1缺失或失活可引起细胞对应激源敏感性增高。

Nqo1通过催化醌类化合物及衍生物进行双电子氧化-还原反应，其产物氢醒能在细胞内稳定结合或排泄出来，可防止醌类及氧自由基等因素损伤细胞DNA，进而减低醌类化合物的致癌和致畸性的危害，从而保护细胞免受氧化还原循环和氧化应激的损伤^[1-2]。研究发现，应激源可刺激激活Nqo1表达，通过CAMP、钙通道、ERK1/2、JNK和PI3K/PKB等信号通路发挥相应的病理生理作用。

图1 Nqo1基因相关信息

来源：RDDC罕见病数据中心

（https://rddc.tsinghua-gd.org/details/gene?gene=WGWKWG）

Nqo1敲除小鼠模型的应用

Nqo1基因能够保护细胞免受氧化还原循环、氧化应激的影响，同时还能够降低肿瘤形成的可能性，Nqo1缺失的小鼠可能更容易对代谢为醌类的化学物质发生皮肤肿瘤。据统计，超过2%的人群为Nqo1突变等位基因纯合，不表达Nqo1基因。超过20%的人群携带一个突变的Nqo1等位基因，并缺乏Nqo1蛋白和活性^[3]，存在更高的化学诱导氧化应激和其他相关疾病的风险。为了研究Nqo1在已知致癌物作用下对人皮肤组织的影响，研究人员利用基因编辑技术，建立了Nqo1基因敲除小鼠模型，并分析了野生型和Nqo1敲除小鼠肿瘤生成情况和易感率。

图2 BPDE诱导Nqo1基因敲除小鼠及野生小鼠皮肤致癌的表型差异^[4]

在模型小鼠中，Nqo1基因的破坏导致了由NAD(P)H积累引起的细胞内氧化还原状态的改变，改变碳水化合物、脂质和核苷酸代谢；引起骨髓中p53和p73水平降低，细胞凋亡减少，进而导致骨髓成髓性增生。同时，对致癌物DMBA和BP的皮肤致癌反应敏感性显著增加。由于缺乏足够的p53诱导，Nqo1缺失小鼠对多环芳烃（PAH）致癌的易感性增加。细胞内氧化还原状态的改变/NAD降低/Nqo1与p53相互作用的缺失，都可能导致p53的快速降解，降低p53对PAHs的应答诱导，增加肿瘤易感性。与野生型小鼠相比，雄性和雌性Nqo1缺失小鼠更容易发生BPDE诱导的皮肤肿瘤，对致癌物的易感性在性别上存在显著差异。

以上结果表明，Nqo1在催化醌的代谢解毒方面具有重要作用，能够保护细胞免受氧化还原循环和氧化应激的影响。在Nqo1缺失小鼠中，p53可能被充分诱导响应BP，但由于NAD水平降低而降解，表明Nqo1与p53相互作用可以使p53趋向稳定。

Nqo1是一种在真核生物中普遍存在的胞质蛋白。在哺乳动物中，它存在于许多器官当中，但在肝脏中含量最多。然而，在人类基因组中，Nqo1在许多肝外组织中活性更高。Nqo1基因在多种因素作用的诱导下进行表达，包括外源生物、氧化剂、抗氧化剂、紫外光、电离辐射等。为了确定Nqo1在外源因素影响下发挥的作用，研究人员建立了Nqo1基因敲除小鼠模型。

图3Nqo1基因敲除小鼠模型的建立^[5]

在胚胎干细胞中采用同源重组的方法破坏Nqo1基因，在载体结构的3’端插入一个单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因，将基因外显子6替换成带有Neo的元件序列，以便后续的基因型筛选。野生型Nqo1^+/+、杂合型Nqo1^+/-、纯合型Nqo1^-/-小鼠作大体和组织学检查包括肝、肺、肾、结肠、胃、十二指肠、脾脏、胸腺、淋巴结、心脏、大脑和骨骼肌。结果发现各器官的解剖生理结构未见明显差异。为检测致癌物对Nqo1敲除小鼠的影响，研究人员将甲萘醌（维生素K3）溶于二甲亚砜中，按照小鼠体重每日腹腔注射给药，连续注射3天，每天观察动物的毒性症状和死亡率。与野生型小鼠相比，Nqo1^-/-小鼠对甲萘醌毒性的敏感性显著增加。

图4 甲萘醌对野生型Nqo1^+/+、杂合型Nqo1^+/-、纯合型Nqo1^-/-小鼠毒性的影响^[5]

在5、10和20mg甲萘醌/公斤体重的剂量下，野生型和Nqo1^-/-小鼠的存活率存在显著差异。随后，研究人员将野生型、杂合子和敲除小鼠血清中天门冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平作为肝损伤的指标。这两种酶都在Nqo1^-/-小鼠中均被发现升高，杂合子小鼠对甲萘醌表现出中等敏感性，而对野生型小鼠血清中指标无影响。

以上结果表明，Nqo1^-/-小鼠对甲萘醌毒性的敏感性显著增加。Nqo1^-/-小鼠的建立，为确定Nqo1在体内对氧化还原循环激活化合物的保护作用，以及这些小鼠在暴露于环境致癌物时是否对癌症敏感，提供了非常重要的工具。（赛业可提供同类型Nqo1基因敲除模型，产品编号：S-KO-03389）

与Nqo1基因相关的疾病有多种，包括皮肤癌、阿尔茨海默症、胃与十二指肠的克罗恩氏病、迟发性运动障碍、儿童白血病缩、乳头状甲状腺微癌、老年性白内障肝细胞腺瘤等。Nqo1是一种可诱导的还原酶，酚类抗氧化剂、多环芳烃、偶氮燃料、缺氧等外界环境因素均可强烈地诱导Nqo1表达，这种可诱导性表达使Nqo1在肿瘤预防和肿瘤治疗中起到重要作用。Nqo1基因敲除小鼠可用于皮肤癌等癌症相关疾病，以及致癌物诱发相关疾病的研究，能够为这些研究领域提供新思路。

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