复苏过程非常关键，直接影响这一株细胞的生长状态和传代能力。一般而言，复苏就是将细胞株从液氮中拿出来后立刻放入-80°C冰箱数分钟，待液氮挥发后迅速放入37℃振荡水浴，俗称“快融”过程，这一过程就是尽快融解细胞内的冰晶，减少对细胞的损伤。下一步就是将细胞放入培养基，一种方法是直接加入到培养基，待第二天细胞贴壁后更换新鲜的培养基；第二种方法是加入数倍体积的培养基混匀后，低速离心去掉对细胞有毒害作用的DMSO，然后把细胞接种到培养皿中。

消化过程会破坏细胞表面蛋白，从而影响细胞状态。目前使用较多的操作是，吸走培养基后先用PBS洗1-2遍，然后加入胰酶进行消化，消化到细胞变圆、少量细胞脱落即可加入培养基进行终止。接下来是离心，除去上清。加入适量培养基将细胞吹匀，再转移到培养皿的过程也很关键。吹打过程中用力要适度，既要避免用力过小细胞未分散，又要避免用力过大细胞悬液沾黏管壁造成损失，还要避免吹打过多机械剪切力伤害细胞。接种细胞后要适度摇晃培养容器，让细胞分布均匀。对于接种的细胞，在空间允许的条件下，尽量平放不要堆着放。此外，关培养箱时需尽量轻柔，有时候细胞出现同心圆分布的情况，就是由于关门太用力，导致培养基晃动，形成纹路。

一般情况下，冻存的细胞越多越好。培养中的细胞，建议在细胞状态好、增殖迅速时就冻存一些，而不是养过很多代用不完再冻存。细胞消化离心去上清后加入细胞无蛋白非程序冻存液调整密度到1×10⁶cell/mL，然后转入冻存管，直接放入-80℃冷冻过夜，注意冻存管摆放不能过于密集，以免处于内部位置的细胞冻存效果差。冻存完成后转入液氮中长期保存。细胞不要长期保存在-80℃冰箱，以免活力下降。

除上述的主要操作步骤以外，常用的试剂存储也很重要。FBS正常存储温度是-20℃，在要使用之前先放到4℃融化，如果放到室温或者水浴锅中融解，血清中的蛋白会大量析出从而影响培养效果。另外胰酶需尽量分装保存，胰酶在室温下失活很快，近期用的放在4℃，其他就存储在-20℃。最后就是细胞需要及时传代和换液，通常为2-3天一次。过于频繁会影响细胞生成长微环境，间隔过长则会有营养匮乏、酸碱度失衡等问题。

一等奖
杨丹丽 北京大学医学部

1. 选择合适的培养基是基本首要。
2. 细胞密度问题：根据细胞的秉性不同，密度也应该不尽相同。有的细胞密一些会状态好，有的细胞稀一些状态会好，所以在传代时要根据细胞的习性及生长速度判断传代比例，摸索合适的密度。
3. 消化时间问题：在自身养细胞的过程中发现，有些细胞消化的时间稍微过一点，后面的状态就会越来越差，所以消化时如果时间把握不好，可以多在镜下观察，细胞之间的连接消失，细胞变圆即可。既要消化到容易吹打下来，又不能消化的太过，一吹就整片脱落不好，要做到细胞单个单个地往下掉，肉眼可见的状态为消化后吹打细胞像沙子一样落下来。
4. 细胞刚传代结束不要频繁的去看细胞。

二等奖
刘秀芳 中国科学院深圳先进技术研究院

本人分享一下七年养细胞的经验，从复苏，传代，冻存三个方面阐述一下：

1. 细胞复苏：快/稳/柔
   • 冻存细胞一定要快速转移到37度水浴锅中。
   • 细胞融化后，所有转移过程，需要擦拭管口消毒，垂悬细胞之时，培养基需要贴壁打入，吹打时需要温柔且有力度的吹打。
   • 低倍镜观察细胞密度后，及时转移到培养箱中。复苏24h后，及时更换新鲜预热的培养基。
2. 细胞传代：新鲜/均匀/定时
   • 完全培养基不能超过两周，尽量保持现配现用，不要反复预热。
   • 细胞第一次传代时，需要计数，按说明书个数传代，每次传代都需要更换新培养瓶，且转移到瓶子时候，吹打细胞让其均匀铺在细胞瓶表面，切记吹打太多次，对细胞造成二次机械损伤。
   • 细胞传代的周期要固定。
3. 细胞冻存：健康/液氮/新鲜
   • 一定要选用健康的细胞，所谓的健康是要在细胞在3-5代以内冻存细胞。
   • 保存细胞的时候，最好置于液氮长时间保存，3个月以内使用可以在-80度保存。
   • 冻存液一定要现配现用或者用新鲜的专用培养基。

二等奖
宁双成 湖南中医药大学

培养细胞无非在于两个字：慎与勤。

慎：

1. 慎防污染
   • 使用细胞房或操作台时疑似污染的离心管、培养瓶、枪头等物品请务必丢弃。
   • 对于培养瓶细胞若出现突然批次性地活性不佳便考虑培养过程哪里出现污染诸如培养液、pbs等就要及时换新。
   • 对于新购或新进的细胞尤其需要注意防止污染带进培养箱等。
2. 慎操作
   • 在细胞复苏、换液、传代、冻存等过程中，“温柔”对待细胞，比如复苏时离心将冻存液吸出，复苏后待细胞贴壁后及时换液排除少量冻存液。
   • 传代时同样通过离心与换液排除胰蛋白酶对细胞的损害。
   • 冻存时将冻存管应梯度降温，不能骤降；复苏时温度可37-38摄氏度快速复溶加培养液后离心脱去上清。
3. 慎思
   • 细胞实验不同于其他实验，所有步骤都应慎思而后行，否则将会带来轻则状态不好，重则出现污染等后果，即使出现污染也应该尽快作补救措施或者其他考虑如重新复苏等防止实验进度的耽搁。

勤：

1. 勤消毒
   • 在细胞房，手但凡要接触培养液、培养瓶或培养箱等都要提前喷酒精消毒，在操作台如若不慎将液体滴在台上也应及时用棉球擦拭，操作台使用前后均用酒精棉球擦拭。
   • 操作台必须提前照紫外灯半小时以上，且维持时间不得超过2-3h，过时请再照台。
2. 勤换液、传代与冻存
   • 勤换液、传代与冻存不仅能保证细胞“肆意”生长的营养条件，有时候还能将污染较小化。

做细胞实验也就半年之久，也是一步步摸爬滚打，非常能理解同行们的苦楚，做细胞实验需要一颗谨慎的心，还有一个勤快的灵魂，祝愿大家能实验顺利！

三等奖
罗嘉亮 南方医科大学

1. 细胞复苏：用大约39℃（比一般37℃稍高）进行水浴摇晃，这样能尽快加速融化，然后能尽快用培养基稀释DMSO 离心沉淀 ：800rpm 5min 低速离心能减少对细胞伤害的同时短时离心能减少DMSO对细胞的毒性，取细胞沉淀置于已加培养基的培养皿中
2. 培养：使用含10%血清的全培（血清在分装前放于四度冰箱融化两天，不要直接水浴或放在常温 以减少析出），培养基可加入适量的双抗（能够不加尽量不加 ，尽可能减少细胞培养条件的变量）。
3. 实验：加抑制剂或药物前一晚，换上基础培养基（能让细胞更好吸收药物）加药物时换回全培。
4. 传代：用含EDTA的胰酶消化，注意不要消化过度，镜下及时观察细胞形态（可放在孵箱加速消化）。
5. 冻存：选择细胞密度大约80%-90%时，且生长状况良好的细胞冻存。含细胞的全培：血清：DMSO=5：4：1 放入冻存盒内 -80℃放大约5小时 然后放在液氮罐中，记得做细胞要一丝一苟，不要养成随意的习惯，因为只要中间一步有错就会导致细胞的形态或生长有所变化，对实验产生不可预料的后果。

三等奖
卢硕 中山大学附属第三医院

1. 打开水浴锅，设置好温度，超净台预约好时间，准备相关的实验耗材（含有10%胎牛血清和双抗1640的完全培养基、PBS、离心管、带孔培养瓶、移液枪、胰酶）。
2. 将冻存的细胞取出，37℃水浴，不要让水浴锅的水接触到瓶盖与瓶身的连接处，待复苏后，在超净台进行实验；把冻存管的液体加入15ml离心管，再加入2ml完全培养基，配平，1000rpm×3min离心，弃上清，加入1ml完全培养基重悬后加入25ml培养瓶中，再加入4ml完全培养基，盖好瓶盖，“十”字摇匀，避免培养基接触瓶口，在瓶身上标记好细胞名词、时间、实验人员名称。
3. 放入37℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱中培养；定期观察细胞的情况，并做好记录。
4. 待培养瓶中细胞汇合度为80~90%时，进行传代。弃旧培养基，加入2mlPBS，轻微摇晃瓶身后弃PBS，加入1ml胰酶后将培养瓶放入细胞培养箱中孵育2min。
5. 时间结束后取出，立即放置在倒置显微镜下观看，细胞皱缩成球形或部分脱离瓶底代表消化已基本完成。
6. 立即培养瓶中加入2ml完全培养基以终止消化，吸取瓶中的培养基吹打瓶璧，使余下的细胞吹至培养基中。
7. 将得到的细胞悬液转移至15ml离心管中，做好标记，1000rpm×3min离心。
8. 弃上清，向离心管中加入2ml培养基，吹打使细胞重悬分散，在新旧的培养瓶中分别各加入1ml重选后的液体，再加入4ml完全培养基，盖好瓶盖，“十”字摇匀，避免培养基接触瓶口，在瓶身上标记好细胞名词、时间、实验人员名称。

三等奖
吴封菲 南方医科大学南方医院

我接触比较多的细胞是人肠系膜脂肪来源间充质干细胞，自己收集标本提取原代，一开始周围的人都说很难，可自己摸索以后，觉得这种细胞很好养~但在原代提取过程中也遇到了问题，一开始是按照文献自己配置的培养基，提取几次都失败了，研磨以后可以看到大量的细胞，可细胞就是不贴壁，直到换用了赛业的培养基才成功提取，现在回想，如果一开始就用的话，可以节省不少时间精力以及珍贵的标本。