盘点： iPS技术的研究历程与应用前景

导读：2012年诺贝尔医学生理学奖授予细胞编程领域的山中伸弥和约翰·格登，前者主要从事诱导多功能干细胞(iPS)方面的开创性研究，而后者从事细胞核移植方面的开创性研究。iPS细胞在再生医疗的应用潜力巨大，不过，人们对它的致癌性还存在一定的担忧。如何在排除致癌风险的情况下最大程度地利用iPS细胞将成为未来重编程领域的重心。

iPS细胞介绍

诱导多能性干细胞 [1] ，通常缩写为iPS细胞，是一类由非多能干细胞(如成体体细胞)被诱导后表达特定基因而成的去分化细胞。

诱导多能干细胞在许多方面类似于天然多能干细胞（胚胎干细胞），诸如干细胞特定基因和蛋白的表达、染色质甲基化模式、倍增期、胚状体形成、畸胎瘤形成、嵌合体自发形成、潜能和多样性，而它们与自然多能干细胞的完全匹配度仍需评估。 [2]

日本京都大学山中伸弥研究小组在2006年首次从小鼠细胞产生iPSC细胞，并在2007年成功应用于人体细胞，因此，他被授予沃尔夫医学奖和诺贝尔医学奖（在2012年与约翰•格登一道荣获此殊荣）。 [3][4][5] 这项研究对于干细胞研究的推动意义重大，它让研究人员能够获得在研究领域和潜在医疗应用中具有重要作用的多能干细胞，从而避免了胚胎干细胞的争议使用。由于iPSC可以从患者自身体细胞形成，人们认为iPSC治疗可完全逃避免疫反应，然而Zhao等人对这个假设提出了质疑。 [6]

根据已有的方法，成体细胞重编程iPS细胞，可能构成重大风险，从而限制其在人体的使用。例如，如果利用病毒在基因组范围内改造细胞，有可能触发致癌基因的表达。在2008年2月，科学家发现的一种技术能够对诱导多能干细胞去除原癌基因，从而拓宽了iPS细胞在人类疾病中的潜在用途。 [7] 2009年4月，研究人员证实在不需要遗传改造成体细胞的情况下生成iPS：通过聚精氨酸锚结构，特定蛋白被链接到一些细胞中，重复处理这些细胞能够诱导细胞具有多能性。 [8] 这类iPSC的缩写名称是piPSCs（蛋白质诱导的多能干细胞）。

iPS细胞研究历程

经过特定干细胞相关基因诱导的非多能干细胞（如成年成纤维细胞）成为iPS细胞，据知iPS倾向于诱导肿瘤形成，因此这项技术受到一定的负面影响。逆转录病毒等病毒载体介导的转染是该技术的途径，其中转染基因包括高级转录调控元件：Oct-3/4(Pou5f1)和Sox2，而其它基因能够提高诱导效率。3-4周后，少量的转染细胞在形态和生化上开始变得类似于多能干细胞，并且能够经形态学筛选、倍增期、报告基因和抗性筛选而分离出。

首次合成iPS

在2006年，日本京都大学的山中伸弥研究团队首次合成诱导多能干细胞。山中伸弥利用一些在胚胎干细胞中尤其重要的基因，经逆转录病毒转染小鼠成纤维细胞，并对处理细胞进行阳性筛选。最终，对于诱导多能干细胞起关键作用的4个基因被分离出：Oct-3/4、SOX2、c–Myc和Klf4。Fbx15+细胞经抗性筛选后分离出目标细胞，而iPS细胞系表明，与胚胎干细胞系初始模式相比，iPS细胞DNA甲基化出现错误，如果注入到发育胚胎中不能合成可用的嵌合体。

第二次诱导小鼠生成iPSC

2007年6月，该小组连同2个其它独立研究小组发表了这一突破性研究，表明成纤维细胞被成功编码成iPS细胞，甚至形成可用的嵌合体。通过逆转录病毒重新激活内源性多能因子，小鼠成纤维细胞被诱导成iPS细胞系，然而，这次研究人员挑选了不同的标记基因，取代Fbx15基因，胚胎干细胞中的重要基因Nanog成为新的标记基因。DNA甲基化模式或可用嵌合体的研究结果表明，Nanog基因是细胞多能性的一个重要决定因素。 [9][10][11][12][13]

不幸的是，4个诱导基因之中有2个（即c-Myc和KLF4）是致癌基因，以及五分之一的植入嵌合体的小鼠形成肿瘤。其后的研究中，山中伸弥报道，缺少c-Myc的情况下，细胞也能够诱导成iPS细胞，整个过程表现出耗时较长和效率不高，但产生的嵌合体却没有发展成癌症。 [14]

两个父亲的小鼠

得克萨斯大学MD安德森癌症中心的生育科学家利用iPS技术仅从2个父源细胞中创造出具有核DNA（nDNA）的小鼠。 [15][16] 来自父源细胞的胎儿成纤维细胞经培养后其中1%的细胞自发丢失Y染色体，如个体特纳氏综合症（X0）。 [17] 这些细胞植入雌性囊胚，在代孕母鼠体内形成雌性嵌合体（X0/XX）。当它们与雄性小鼠（XY）交配时，一些后代具有初始父亲和交配父亲的nDNA，但是不能形成雌性囊胚或怀孕母鼠。具有2个父亲的雄性和雌性小鼠都是可行的。

人体诱导多能干细胞HiPS

2007年11月，一个具有里程碑意义的试验出现了， [1][18]人体成体细胞被诱导成iPSC，2个独立的研究小组公布了这项研究，一个是威斯康星-麦迪逊大学詹姆斯•汤姆森指导的研究发表在Science [19]；另一个是日本京都大学山中伸弥和同事的研究发表在Cell上。 [20]利用之前在小鼠模型中采用的原理，山中伸弥成功地将人体成纤维细胞转化成多能干细胞，逆转录体系利用的4个关键基因是OCT3/4、SOX2、KLF4，和c-Myc，而汤姆逊和同事利用用的是OCT4、SOX2、NANOG和LIN28，转染载体使用的是慢病毒。

转录因子方法的局限

尽管传统方法（山中伸弥和Thomson开创的转录因子诱导法）很好地证实体细胞可重新编程为iPS这一观念，但是这种方法仍要克服有许多关键性挑战：

生产量：重编程细胞的成功率低的令人难以置信，例如，在山中伸弥的小鼠研究中，体细胞重编程iPS的比例为0.01-0.1％， [9]这一低成功率要求研究人员掌握精确时间、平衡点以及重新编程基因的绝对表达水平，同时要求他们观察初始体细胞群或繁衍群中的较少的遗传学和表观遗传学变化。

基因组插入：转录因子整合到基因组上，这限制了转录因子方法的使用，因为插入外源基因的目标细胞基因组面临突变风险。 [21]为了避免基因组插入事件，一个常见的策略是利用不同的插入载体，质粒、腺病毒和转座子载体都被研究过，然而它们往往表现出较低的成功率。 [22][23][24]

肿瘤：另一个主要挑战已经在上文提到过，一些重编程因子是致癌基因，它具有潜在的致癌风险。对抑制基因p53（肿瘤的一个主要调控因子）进行失活或缺失处理，显著地提高重编程效率。 [25]因此，需要在重新编程效率和肿瘤发生之间寻找平衡点。

重编程不完全：重编程在转化完整性方面面临挑战，这之所以构成显著挑战，是因为全基因组水平表观遗传密码必须重新格式化成特定细胞类型，为完全重编程新细胞做准备。不过，3个独立研究小组发现，小鼠胚胎成纤维细胞来源的iPS细胞被注入四倍体囊胚后，能够产生完全来自于iPS的活体小鼠，从而终止了关于胚胎干细胞和诱导多能干细胞在多能性方面等同性的争论。 [26]但是，下面列举的一些其它技术证实iPS与胚胎干细胞相比存在的缺陷和不足。

用小分子化合物模拟转录因子

为避免问题（1）和（2），主要策略之一是利用小分子化合物模仿转录因子的作用。这些分子化合物可补偿一些重编程因子，后者不能有效靶定基因组或引起编程失败，因此它们提高了重编程效率。此外，他们还避免了基因组整合，在某些情况下它引起肿瘤发生。2008年利用这一策略开展几个关键实验。Meltonetal.研究了组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂丙戊酸的作用，他们发现其提高重编程效率100倍（相对于山中伸弥的传统转录因子方法）。 [27]研究人员提出，这种化合物像转录因子c-Myc一样引起信号通路。相同类型的补偿机制出自于对Sox2基因的模仿，2008年，Dingetal.利用BIX-01294抑制组蛋白甲基转移酶（HMT），然后将其结合在质膜上激活的钙离子通道从而提高重编程效率。 [28]可以预见的是，这类实验将寻找更有效提高重编程的小分子化合物，最终目标是要发现重编程因子和重编程化合物的鸡尾酒，从而有效和可靠地将体细胞重新编程iPS细胞。

取代逆转录病毒的替代载体

为避免肿瘤发生和低产出率，另一关键策略是利用替代载体类型：腺病毒、质粒和裸露的DNA或蛋白复合物。

2008年，Hochedlingeretal.利用腺病毒将4个转录因子转运到小鼠皮肤和肝细胞的DNA中，从而产生类似于胚胎干细胞的iPS细胞。腺病毒具有其它载体不具有的独特性，它不会将自身基因整合到宿主细胞中，避免插入突变的潜在危害。 [29]2009年，Freedetal.证实人类成纤维细胞成功重编程iPS细胞。 [30]腺病毒的另一个优点是，在较短时期内见证重编程的高效发生。

在2008年，Freedetal.再一次在iPS领域做出重大贡献，他们能够通过质粒转移4个必需基因。 [31] 通过利用2个质粒（第一个表达c-Myc基因；另一个表达3个因子Oct4、Klf4和Sox2）进行转染操作，山中伸弥研究小组成功地重编程小鼠细胞。尽管质粒方法避开了病毒载体，它仍需要致癌基因进行重编程。这些方法的另一主要问题是转染效率较低。

此外，研究表明转染质粒被整合到寄主基因组，因此它们仍构成插入突变的潜在风险。由于非逆转录病毒方法已经证实是低效率的，研究人员曾试图利用piggyBac转座子系统改善该方法，一些研究已经证明，该系统有效递送关键性转录因子，却不在寄主细胞基因组中留下足迹突变。

药物样化合物和重组蛋白

2009年，Ding和同事证明，一个成功的重编程替代方法是利用药物样化合物，它是关于重编程特定机制的首个应用于人体细胞的方法。通过利用纯化蛋白将成体细胞重编程胚胎样细胞，Ding解决了基因组插入问题。 [32]一旦他的研究小组成功地证实这一点，转染效率问题就能解决，其中仿生学是Ding的整体策略。此外，他研究了MET（由间充质细胞向上皮细胞转变）的自然发生过程，其中成纤维细胞去分化为干细胞样阶段。Ding首次研究了药物样分子抑制能参与MET进程的化合物，这些化合物包括TGFB（转化生长因子β）和MEK（有丝分裂原活化蛋白激酶）。Ding识别出最具活性的分子，然后研究当单独或组合使用时其对iPS生成的作用。他总结出2个化合物（ALK5抑制剂SB431412和MEK抑制剂PD0325901）在组合使用时能高效诱导成纤维细胞去分化为iPS细胞。

尽管这一技术将经典遗传方法的效率提高了100倍，Ding试图做的更好，他继续利用仿生学策略获取其它的细胞存活通路。在筛查该通路中多个化合物之后，研究小组将重点放在一种称为Thiazovivin的复合物上。将这一蛋白质和之前的2个化合物结合使用，研究小组把经典方法的效率提高了200倍。此外，该方法仅需2周就可完成重编程，而经典方法完成重编程需要4周时间。该方法的另一个优点是，它克服了基因插入问题，因为药物样分子来自于自然生物过程。

microRNA分子

在2009年，Blellochetal.证实了胚胎干细胞特异microRNA分子（如miR-291、miR-294和miR-295）的表达，通过作用下游的c-Myc基因，提高多能细胞诱导效率。 [33]2011年4月，Morriseyetal.研究表明，利用microRNA可将重编程效率提高到Ding所证实的水平。microRNA是小分子RNA，它能够结合到信使RNA的互补序列，并抑制基因表达。Morrisey研究小组研究了microRNAs在肺发育过程中的作用，并推测microRNA可能阻断山中伸弥发现的4个转录因子的表达。

诱导基因

iPS细胞生成主要依赖于诱导基因

Oct-3/4和Sox基因家族某些成员（SOX1，SOX2，SOX3，和SOX15）已被确定为关键转录调控因子参与诱导过程，缺少它们的情况下诱导无法进行，此外，其它基因已被确定为提高诱导效率。如：若KLF家族一些成员（KLF1，KLF2，KLF4和KLF5）、Myc家族（c-myc、L-myc基因和N-myc基因）、Nanog基因以及LIN28基因。

Oct-3/4（Pou5f1）：Oct-3/4是octamer("Oct")转录因子的一个家族，并在维持多能性方面起着至关重要的作用。在Oct-3/4+细胞（如卵裂球和胚胎干细胞）中缺少Oct-3/4基因，会导致滋养层细胞自发分化，Oct-3/4基因的存在能引起胚胎干细胞的多能性和分化潜能。"Oct"家族的其它基因，如Oct1和Oct6，不能诱导重编程，因此这表明Oct-3/4基因在该家族中对于诱导重编程具有独特作用。

Sox家族：Sox家族基因具有类似于Oct-3/4的多能性，但是，相比于Oct-3/4只能在多能干细胞中表达，Sox家族基因能在多能干细胞和单能干细胞中表达。山中伸弥和詹尼士等研究人员使用Sox2作为诱导重编程的初始基因，事实上，Sox家族中的其它基因据发现也具有此功能，在诱导iPS的效率上SOX1等同于Sox2，SOX3，SOX15，SOX18基因也能够产生iPS细胞，但是效率下降。

Klf家族：KLF家族的Klf4最初由山中伸弥发现，后被Jaenischetal确认为小鼠iPS细胞诱导因子，随后山中伸弥等人发现其是人体iPS细胞诱导因子之一。不过Thomsonetal.报道，Klf4不是生成人体iPS所必需的，事实上，它不能诱导人体iPS细胞生成。KLF2和Klf4被认为是能够诱导iPS细胞的因子，此外，KLF1和KLF5基因也具有这种功能，只是效率低些。

Myc家族：Myc家族基因是关联肿瘤的原癌基因。山中伸弥课题组和詹尼士课题组共同证实，c-myc是参与小鼠iPS生成的诱导因子之一，随后山中伸弥课题组证实它也是诱导人体iPS的因子之一，不过，上述2个课题组连同约翰•霍普金斯大学研究表明，c-myc基因是诱导人体iPS生成的不必要因子。在诱导iPS细胞时“myc”基因的使用将对iPS细胞应用临床构成挑战。c-myc诱导的iPS移植后引起25％的小鼠形成致死畸胎瘤，N-myc和L-myc被识别具有与c-myc等同的诱导作用，从而取代c-myc的使用。

Nanog：在胚胎干细胞中，Nanog、Oct-3/4和Sox2是诱导多能性细胞所必要的，因此，人们惊讶于，山中伸弥等人报告称Nanog不是诱导过程所必需的，尽管Thomsonetal.指出Nanog作为效用因子能够诱导iPS细胞。

LIN28：在胚胎干细胞和胚胎癌细胞中，LIN28是关联分化和增殖的mRNA结合蛋白。Thomsonetal.证实其是诱导iPS的因子之一，不过它是非必需的。

细胞存储

iPS细胞具有广阔应用前景，私营部门已着手研究iPSC主流用处的可能性，至少有一家公司已向公众提供iPSC细胞的收集和存储服务，声称其细胞库有助于避免从头合成突变（denovomutations） [34]。不过，细胞可能发生突变和损伤，新的iPSC技术还缺少信服证据去支持iPSC细胞发生的精确机制。因此，还不能确信的是，刚刚起步的细胞库是否有利，即便iPSC技术已被开发出。

一个开放的未来

由于上面提到的5个问题，iPS细胞的诱导仍面临挑战。在效率与基因组融合之间，研究人员需要寻求关键意义的平衡点。不依赖于基因融合的大多数方法表现出效率低下，而那些依靠外源基因融合的技术却面临重编程不充分和肿瘤发生的问题。当然，人们已经尝试大量的技术和方法。另一大策略是对iPS细胞蛋白质组进行鉴定。斯坦福大学的Wu课题组在这方面取得了显著进展。 [35]进一步研究和新战略将有助于我们找到解决上述5个主要挑战的最佳方案。一个让人感兴趣的实验是尝试将这些策略的优点整合成一个最终有效的技术，用于重编iPS细胞。

另一方法是利用患者来源的iPS细胞以确定针对表现型的治疗药物。例如，外胚层发育不良综合征（EEC）患者提供的iPS细胞系（其中的P63出现突变），表现出异常的上皮表型，小分子化合物可治疗一部分该病症 [36]。

iPS生化分子特征

特征

在以下方面，iPS细胞具有与多能干细胞非常相似的特征。

细胞生物学特性

形态：iPSCs形态类似于胚胎干细胞：圆状、大核仁以及胞浆小。iPSC细胞群和胚胎干细胞群也相似，人体iPSC细胞群呈现长边、扁平和紧密的特征，人类胚胎干细胞群也是如此。此外，小鼠iPSC细胞群和小鼠胚胎干细胞群一样表现出更质密、稍扁平的特征。

生长特性：倍增期和有丝分裂是胚胎干细胞特征，后者必须具有自更新能力。而iPS细胞分裂快和自更新活跃，并具有与胚胎干细胞一样的增殖和分裂速度。

干细胞标记物：iPS细胞表达出胚胎干细胞表面具有的表面抗原标记。人体iPSCs表达出人类胚胎干细胞特有的标记分子，包括SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E和Nanog。此外，与小鼠胚胎干细胞一样，小鼠iPS细胞表达出SSEA-1，但不表达SSEA-3和SSEA-4。

干细胞基因：iPSCs的表达基因类似于未分化胚胎干细胞的，其中包括Oct-3/4、Sox2、Nanog、GDF3、REX1、FGF4、ESG1、DPPA2、DPPA4和hTERT。

端粒酶活性：端粒酶是细胞分裂（50次Hayflick界限的限制）所必要的，人类胚胎干细胞的端粒酶活性处于高水平以维持自我更新和增殖，iPSCs同样具有处于高水平的端粒酶活性，并表达出端粒酶逆转录酶，它是端粒酶蛋白质复合体的必要组成部分。

iPS细胞具有类似于胚胎干细胞的分化潜能

神经分化：iPS细胞分化成神经元，后者表达出βIII-tubulin、tyrosinehydroxylase、AADC、DAT、ChAT、LMX1B和MAP2。儿茶酚胺相关酶表明iPSC细胞，像胚胎干细胞一样，以分化成多巴胺能神经元。细胞分化后干细胞相关的基因表达水平下降。

心脏分化：iPS细胞分化成能够自发地跳动的心肌细胞，后者表达TNTC、MEF2C、MYL2A、MYHCβ和NKX2.5细胞。细胞分化后干细胞相关的基因表达水平下降。

畸胎瘤形成：iPS细胞注射免疫缺陷小鼠体内，九周后自发形成的畸胎瘤。畸胎瘤是多谱系肿瘤，包括内胚层、中胚层和外胚层的组织，这一点不同于其它肿瘤（仅有一种细胞类型）。畸胎瘤在多能性测试方面具有里程碑意义。

胚状体：人体胚胎干细胞在培养中自发形成球状类胚体结构，被称为“胚体”，它包括有丝分裂核、分化的人体胚胎干细胞和来自3胚层的外周分化细胞。iPS细胞也形成胚状体，并具有外周分化细胞。

嵌合体小鼠：人体胚胎干细胞天然驻留在囊胚内细胞团内，当滋养层分化成胚胎外组织时，囊胚内细胞团在成胚内随之分化成胚体。中空的滋养层细胞无法形成胚胎，因此胚胎干细胞在成胚内分化并形成胚体。通过微型移液器将iPS细胞注射到滋养层细胞中，囊胚转变成雌性受体，研究人员创建出嵌合体的小鼠幼仔，那些iPSC处理的小鼠全身上下具有10％-90％的嵌合体。

四倍体互补：来自小鼠胚胎成纤维细胞的iPS细胞注入四倍体囊胚（仅形成胚外组织）内，形成非嵌合体的完整小鼠，它具有生育能力，只是成功率很低。 [37][38][39]

表观遗传修饰

启动子的脱甲基化：甲基化是指甲基集团转移到DNA碱基上，其中典型的是甲基集团转移到CpG位点的甲基胞嘧啶上。通过抑制蛋白活性或招募具有抑制基因表达作用的酶，广泛基因甲基化作用能够干扰基因表达。因此，基因甲基化能够有效沉默基因表达。细胞多能性相关基因（Oct-3/4、Rex1和Nanog）的启动子在iPSC中是去甲基化的，这证实了iPSC中的启动子活性以及细胞多能性相关基因的启动和表达。

DNA甲基化：在胞嘧啶甲基化模式上，人体iPS细胞高度类似于胚胎干细胞，然而，多个iPS细胞系在上千个位点上具有不同的序列，其中一半序列类似于体细胞系，另一半是iPSC细胞特有的。多个研究发现，iPS细胞没有重编程成胚胎干细胞的状态。 [40]

组蛋白去甲基化：组蛋白是结构化定位DNA序列的压缩蛋白，能够通过染色质相关修饰影响基因表达活性。关联到Oct-3/4、Sox2和Nanog的H3组蛋白是去甲基化的，这表明上述3个基因处于表达状态。

iPS在再生医学的安全性

人们对于iPS在临床上应用的主要关注点在于其倾向于形成肿瘤。 [41]同胚胎干细胞一样，iPSC被注射到免疫缺陷小鼠时容易形成畸胎瘤。畸胎瘤的形成被认为是干细胞再生医学的一大障碍。

由于仅通过修饰就可在一段时间内高效诱导iPSCs，人们往往预测其具有较低安全性和较高致癌性。所有诱导iPSC的基因在某个途径上都会关联到肿瘤，其中的一些基因是已知的致癌基因，包括Myc家族，没有Myc家族参与iPSC生成，诱导效率急剧下降。

通过重组蛋白诱导iPSC的非遗传方法已被证实有效，然而其效率相当低。 [8]对该方法改进后将提高诱导效率，并产生较为安全的iPSC。人们认为另一种利用腺病毒或质粒的方法往往比逆转录病毒的方法较为安全。

将来在iPSC领域的研究会直接检测iPSC致癌性，从而推动该方法应用于再生医学治疗。这项研究至关重要，因为iPS细胞不仅形成畸胎瘤，而且移植iPSC的小鼠具有较高的恶性肿瘤死亡率 [42]。近来，干细胞杂志刊登一篇论文，指出iPSC细胞比胚胎干细胞具有较高的致癌性，这映证了人们对iPS安全性的忧虑。 [43]

iPS技术的纵观

从iPS细胞首次在实验动物中诞生，到iPS细胞建立方法的逐渐完善，再到iPS细胞研究在人类细胞中获得成功，最后到iPS细胞应用于疾病模型动物的治疗，整个过程只用了短短一年半的时间。这种快速发展的原因在于对过去大量知识的积累和运用，更在于观念上的大胆创新。今后，iPS细胞的研究会成为生命科学领域的一个重要方向，随着技术的不断进步，相信iPS细胞研究的进展会比人们想象中更为迅速。今天，我们从iPS细胞上看到了它为人类疾病治疗所带来的希望和契机，我们更期待在不远的将来，iPS细胞的不足会在人们的努力下逐一地被克服，iPS细胞最终有望真正用于造福人类健康。

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备注：原文题目为“iPS技术的研究历程和应用前景盘点”，转自生物探索，如侵权请联系删除。

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