PLoS One：中山大学黄军就副教授再发CRISPR新成果

来自中山大学的研究人员报告称，他们利用CRISPR/Cas9系统构建出了Slx2基因敲除小鼠模型，证实了CRISPR/Cas9技术可以推动对睾丸特异性X连锁基因的体内功能研究。这一研究成果发布在11月24日的《PLoS One》杂志上。

中山大学生命科学学院的黄军就(Junjiu Huang)副教授和松阳洲(Zhou Songyang)教授是这篇论文的共同通讯作者。在过去的十多年， 松阳洲教授在分子细胞学领域的研究中做出了独创性的贡献。他对人体细胞端粒调节机理和胚胎干细胞的蛋白组学和功能性的研究处于国内外相关领域的前沿。 “80后”的黄军就副教授是位年轻的学者，今年他的研究团队因采用CRISPR/Cas9首次改造了人类胚胎DNA而受到国内外的广泛关注。

精子发生是生成精子的一个生理过程。它是一个复杂且受到严密调控的过程，可分为三个阶段：有丝分裂、减数分裂及精子形成。在哺乳动物减数分裂前期I，X和Y 染色体失活，分隔到称作为XY body的周边核亚区域内。在减数分裂过程中许多DNA损伤反应蛋白如53BP1都定位在XY body上。有人认 为，XY body的组成元件促成了减数分裂性染色体失活(MSCI)。如果MSCI发生缺陷，有可能会出现减数分裂不育或非整倍体。

以往的研究表明，SLX2（也称作1700013H16Rik或XLR6）可能与减数分裂染色体失活有关。SLX2是XLR家族的成员。XLR蛋白家族是一 群包含Cor1结构域的蛋白，它们的编码基因定位在X染色体上。XLR家族包含有40个成员，其中一些参与了精子发生。人们怀疑，SLX2在这一过程中发 挥了重要的作用，因为它在减数分裂前期I时表达于睾丸中，主要定位在XY body上。然而，至今还没有好的模型来调查它在精子发生中所起的作用。

基因组编辑工具是通过诱导双链DNA断裂(DSBs)来实现位点特异性基因编辑。DSBs通过容易出错的非同源末端连接(NHEJ)或高保真的同源重组修复 (HDR)机制进行修复，由此促成插入和缺失（Indels）或精确的基因替换。靶基因插入与缺失往往会导致移码突变，破坏靶基因表达。常使用的基因组编 辑工具包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系统。

在这些基因组编辑工具中，CRISPR/Cas9发展最快速。CRISPR/Cas9系统由导向RNA（gRNA）和Cas9核酸内切酶构成，通过设计新的 gRNA可以让CRISPR/Cas9轻易地靶向几乎所有的基因。gRNA-Cas9复合物通过RNA-DNA互补来结合靶位点，由此激活Cas9核酸酶。随后激活的Cas9核酸酶将会切割靶位点。要靶向一个新基因，研究人员只需改变gRNA 5’末端的20个核苷酸序列。CRISPR/Cas9系统的简易和高效性使得它被广泛应用于许多物种中。受惠于CRISPR/Cas9系统的开发，它成为了在1个月内生成基因改造首建鼠的一种常规方法。

在这篇文章中研究人员报告称，他们采用CRISPR/Cas9系统构建出了Slx2基因敲除小鼠来研究Slx2在体内的功能。他们将靶向Slx2不同区域的 两种gRNAs分别与Cas9 mRNA一同注入到小鼠受精卵中。在4-5个月的时间内获得了基因敲除小鼠。对比野生型小鼠，Slx2基因敲除小鼠有正常的睾丸和附睾。组织学检测睾丸切片显示，敲除Slx2对精子发生的3个主要阶段：有丝分裂、减数分裂和精子形成不产生影响。

此外，研究人员通过免疫荧光法进一步证实了破坏Slx2不会影响精原干细胞的数量、减数分裂进程或XY body形成。由于在Slx2基因敲除小鼠中精子发生是正常的，这些小鼠具有生育能力。

研究结果证实了，Slx2自身并非小鼠精子发生的必需基因，CRISPR/Cas9可以加速对睾丸特异性X连锁基因的体内功能研究。

参考文献：

CRISPR/Cas9 Promotes Functional Study of Testis Specific X-Linked Gene In Vivo

原文作者为生物通/何嫱，赛业生物特别分享。