CRISPR女神Nature发文:超精准的CRISPR-Cas9!

日期: 2017年09月22日


    

导读:加州大学伯克利分校和麻省总医院的科学家已经确定了Cas9蛋白中的一个关键区域,这个区域控制了CRISPR-Cas9是否能在靶标DNA序列上准确定位,并扭转DNA,让其产生一种超精确的基因编辑器,达到迄今为止所能达到的最低脱靶率。 今天,赛业小编为您推荐“CRISPR女神Nature发文:超精准的CRISPR-Cas9!”,详情如下:


加州大学伯克利分校和麻省总医院的科学家已经确定了Cas9蛋白中的一个关键区域,这个区域控制了CRISPR-Cas9是否能在靶标DNA序列上准确定位,并扭转DNA,让其产生一种超精确的基因编辑器,达到迄今为止所能达到的最低脱靶率。

  

CRISPR研究先驱Jennifer A. Doudna


这一研究成果公布在9月21日的Nature杂志上,由CRISPR研究先驱Jennifer A. Doudna领导完成,Doudna因在CRISPR基因组编辑技术中屡获突破而名声大噪,近年来她的研究组也在CRISPR技术原理解析和应用方面取得了不少成果,如上周他们报道了一个crRNA结合Cas13a (LbaCas13a)的晶体结构,分辨率为2.0Å,通过解析这一结构,研究人员描述了Cas13a酶如何产生功能性crRNAs,以及在靶标RNA识别之前,其催化活性如何被封闭。(破解RNA靶向CRISPR酶Cas13a的作用机制)


基因编辑工具的快速发展令整个生物学研究领域疯狂,目前第三代DNA剪刀的主角是CRISPR,这是一种比其前身更快更便宜的工具。CRISPR-Cas9和CRISPR-Cpf1通过切除小的DNA序列,沉默或降低错误基因的表达。但是Cas9核酸酶的潜在脱靶效应,一直是CRISPR技术的一个主要障碍。


在最新这项研究中,这一研究组成员认为,主导DNA切割的一个主要调控因子的蛋白结构域是关键,通过改进它就能提高CRISPR编辑的准确度。这种方法可以帮助科学家们定制Cas9的变体:利用结合并切割DNA的蛋白,最大限度地减少CRISPR-Cas9在错误的地方编辑DNA的几率,这也是进行人体基因治疗时的一个关键考虑因素。


“我们发现,Cas9中REC3结构域上即使是细微的变化,都会造成脱靶和打靶编辑的区别,这表明这个结构域是可以进行深度诱变,从而提高靶向特异性的重要候选元件,”文章的第一作者之一,Jennifer Doudna实验室的研究生Janice Chen说。


超精准Cas9


自2012年以来,Doudna和她在马普传染生物研究所的同事Emmanuelle Charpentier就开始利用Cas9蛋白构建一种便宜,精确,且易于操作的基因编辑方法,研究人员一直都在试图减少脱靶编辑的几率,虽然说提高保真性能帮助基础研究,但是在临床上,这种准确度更加至关重要,因为任何脱靶的DNA切割都有可能会导致关键基因失去功能,导致永久的,意想不到的副作用。


在过去两年中,这两个研究组设计出了高精度的Cas9蛋白:一种是特异性加强版eSpCas9(1.1),以及一种高保真度SpCas9-HF1,研究人员希望能了解为何这些Cas9蛋白要比野生型蛋白具有更高的特异性。


目前在CRISPR-Cas9研究中,研究人员创建了一个单导向RNA(sgRNA),这是一种包含20个核糖核酸的RNA分子,与一种特异性靶向DNA序列互补,并将其加在Cas9上。这种导向RNA能帮助Cas9定位在互补DNA上,结合并切割DNA。但是Cas9-sgRNA 复合物也能结合到不那么匹配的DNA序列上,导致脱靶切割。


2015年,Doudna实验室发现了一个Cas9的构象开关,当导向RNA与DNA靶标匹配时这个开关就会被激活,研究人员指出只有当RNA和DNA匹配紧密的情况下,Cas9的3D结构,特别是HNH核酸酶结构域的构象才会发生改变,激活Cas9的催化作用。但是如何感知这个构象开关上游核酸的过程,依然未知。

  

CRISPR-Cas9


Cas9蛋白(灰色)是一种导向RNA核酸酶,能结合并切割DNA序列(深蓝色双螺旋)。在靶标结合后,Cas9蛋白结构域就会发生构象重排(单个氨基酸运动用火箭尾来表示),激活Cas9-sgRNA 复合物的活性。REC3结构域(蓝绿色)负责感测靶标,通知REC2结构域(品红色)向外旋转,打开HNH核酸酶结构域(黄色)


在最新这项研究中,研究人员采用了单分子FRET(Förster共振能量转移)这一技术来精确测量当Cas9-sgRNA蛋白复合物与DNA结合时,复合物中的各种蛋白质结构域(特别是REC3,REC2和HNH)如何变化。


首先他们发现eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1的特异性优势,这两种特殊Cas9的HNH构象开关的阈值比野生型Cas9蛋白高得多,因此eSpCas9 (1.1)和SpCas9-HF1变体在绑定到脱靶序列时不太可能激活催化作用。之后研究人员还发现REC3结构域能感测靶标结合的准确性,它能通知REC2结构域向外旋转,为HNH核酸酶结构域打开路径,激活催化活性。从而Cas9的这种催化构象就能切割靶标DNA的两条链。


同时,Chen等人还发现,如果突变REC3,就会改变Cas9蛋白的特异性,只有导向RNA与靶标DNA十分匹配时HNH核酸酶才能激活。


由此他们构建出了一种升级型超精准的Cas9,被命名为 HypaCas9,这种酶能在保持打靶效率的基础上,更好的识别人体细胞中打靶和脱靶位点之间的区别。


“如果突变REC3中的某些氨基酸残基,就能调整Cas9在打靶活性与提高特异性之间的平衡,我们能够找到在预期靶标处的最佳平衡点,大大减少脱靶事件,”Chen说。


之后研究人员将继续探索Cas9的结构,功能动态之间的关系,Doudna及其团队希望能进一步加强蛋白的精确敏感性,可靠而有效地进行各种遗传编辑。


原文标题:


Enhanced proofreading governs CRISPR–Cas9 targeting accuracy


来源:生物通——由赛业生物科技有限公司转载发布

  

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