CRISPR女神Nature发文：超精准的CRISPR-Cas9！

导读：加州大学伯克利分校和麻省总医院的科学家已经确定了Cas9蛋白中的一个关键区域，这个区域控制了CRISPR-Cas9是否能在靶标DNA序列上准确定位，并扭转DNA，让其产生一种超精确的基因编辑器，达到迄今为止所能达到的最低脱靶率。 今天，赛业小编为您推荐“CRISPR女神Nature发文：超精准的CRISPR-Cas9！”，详情如下：

加州大学伯克利分校和麻省总医院的科学家已经确定了Cas9蛋白中的一个关键区域，这个区域控制了CRISPR-Cas9是否能在靶标DNA序列上准确定位，并扭转DNA，让其产生一种超精确的基因编辑器，达到迄今为止所能达到的最低脱靶率。

这一研究成果公布在9月21日的Nature杂志上，由CRISPR研究先驱Jennifer A. Doudna领导完成，Doudna因在CRISPR基因组编辑技术中屡获突破而名声大噪，近年来她的研究组也在CRISPR技术原理解析和应用方面取得了不少成果，如上周他们报道了一个crRNA结合Cas13a (LbaCas13a)的晶体结构，分辨率为2.0Å，通过解析这一结构，研究人员描述了Cas13a酶如何产生功能性crRNAs，以及在靶标RNA识别之前，其催化活性如何被封闭。（破解RNA靶向CRISPR酶Cas13a的作用机制）

基因编辑工具的快速发展令整个生物学研究领域疯狂，目前第三代DNA剪刀的主角是CRISPR，这是一种比其前身更快更便宜的工具。CRISPR-Cas9和CRISPR-Cpf1通过切除小的DNA序列，沉默或降低错误基因的表达。但是Cas9核酸酶的潜在脱靶效应，一直是CRISPR技术的一个主要障碍。

在最新这项研究中，这一研究组成员认为，主导DNA切割的一个主要调控因子的蛋白结构域是关键，通过改进它就能提高CRISPR编辑的准确度。这种方法可以帮助科学家们定制Cas9的变体：利用结合并切割DNA的蛋白，最大限度地减少CRISPR-Cas9在错误的地方编辑DNA的几率，这也是进行人体基因治疗时的一个关键考虑因素。

“我们发现，Cas9中REC3结构域上即使是细微的变化，都会造成脱靶和打靶编辑的区别，这表明这个结构域是可以进行深度诱变，从而提高靶向特异性的重要候选元件，”文章的第一作者之一，Jennifer Doudna实验室的研究生Janice Chen说。

超精准Cas9

自2012年以来，Doudna和她在马普传染生物研究所的同事Emmanuelle Charpentier就开始利用Cas9蛋白构建一种便宜，精确，且易于操作的基因编辑方法，研究人员一直都在试图减少脱靶编辑的几率，虽然说提高保真性能帮助基础研究，但是在临床上，这种准确度更加至关重要，因为任何脱靶的DNA切割都有可能会导致关键基因失去功能，导致永久的，意想不到的副作用。

在过去两年中，这两个研究组设计出了高精度的Cas9蛋白：一种是特异性加强版eSpCas9（1.1），以及一种高保真度SpCas9-HF1，研究人员希望能了解为何这些Cas9蛋白要比野生型蛋白具有更高的特异性。

目前在CRISPR-Cas9研究中，研究人员创建了一个单导向RNA（sgRNA），这是一种包含20个核糖核酸的RNA分子，与一种特异性靶向DNA序列互补，并将其加在Cas9上。这种导向RNA能帮助Cas9定位在互补DNA上，结合并切割DNA。但是Cas9-sgRNA 复合物也能结合到不那么匹配的DNA序列上，导致脱靶切割。

2015年，Doudna实验室发现了一个Cas9的构象开关，当导向RNA与DNA靶标匹配时这个开关就会被激活，研究人员指出只有当RNA和DNA匹配紧密的情况下，Cas9的3D结构，特别是HNH核酸酶结构域的构象才会发生改变，激活Cas9的催化作用。但是如何感知这个构象开关上游核酸的过程，依然未知。

Cas9蛋白（灰色）是一种导向RNA核酸酶，能结合并切割DNA序列（深蓝色双螺旋）。在靶标结合后，Cas9蛋白结构域就会发生构象重排（单个氨基酸运动用火箭尾来表示），激活Cas9-sgRNA 复合物的活性。REC3结构域（蓝绿色）负责感测靶标，通知REC2结构域（品红色）向外旋转，打开HNH核酸酶结构域（黄色）

在最新这项研究中，研究人员采用了单分子FRET（Förster共振能量转移）这一技术来精确测量当Cas9-sgRNA蛋白复合物与DNA结合时，复合物中的各种蛋白质结构域（特别是REC3，REC2和HNH）如何变化。

首先他们发现eSpCas9（1.1）和SpCas9-HF1的特异性优势，这两种特殊Cas9的HNH构象开关的阈值比野生型Cas9蛋白高得多，因此eSpCas9 （1.1）和SpCas9-HF1变体在绑定到脱靶序列时不太可能激活催化作用。之后研究人员还发现REC3结构域能感测靶标结合的准确性，它能通知REC2结构域向外旋转，为HNH核酸酶结构域打开路径，激活催化活性。从而Cas9的这种催化构象就能切割靶标DNA的两条链。

同时，Chen等人还发现，如果突变REC3，就会改变Cas9蛋白的特异性，只有导向RNA与靶标DNA十分匹配时HNH核酸酶才能激活。

由此他们构建出了一种升级型超精准的Cas9，被命名为 HypaCas9，这种酶能在保持打靶效率的基础上，更好的识别人体细胞中打靶和脱靶位点之间的区别。

“如果突变REC3中的某些氨基酸残基，就能调整Cas9在打靶活性与提高特异性之间的平衡，我们能够找到在预期靶标处的最佳平衡点，大大减少脱靶事件，”Chen说。

之后研究人员将继续探索Cas9的结构，功能动态之间的关系，Doudna及其团队希望能进一步加强蛋白的精确敏感性，可靠而有效地进行各种遗传编辑。

原文标题：

Enhanced proofreading governs CRISPR–Cas9 targeting accuracy

来源：生物通——由赛业生物科技有限公司转载发布

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