【创新】谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9新工具

日期: 2017年12月20日


    

导读:近期,孙际宾课题组开发的CRISPR/Cas9 基因编辑工具基于Cas9和gRNA表达盒重构,Cas9和gRNA质粒共转化方法不仅克服了Cas9毒性还促使gRNA有效终止。本技术的基因敲除和基因插入效率分别达到60.0%和62.5%,另外开发的CRISPR/Cas9介导的ssDNA 重组能够精准的引入和点突变,效率超过80%。此方法也可对谷氨酸棒状杆菌进行双位点有效编辑。赛业小编为您推荐“【创新】谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9新工具”,详情如下:


Development of a CRISPR/Cas9 genomeediting toolbox for Corynebacterium glutamicum


本文由中科院天津工业生物技术研究所孙际宾课题组于2017年11月17日发表在Microb Cell Fact。


谷氨酸棒状杆菌是重要的工业生产菌,可用于生产各类氨基酸及天然/非天然产物。作者开发的CRISPR/Cas9 基因编辑工具基于Cas9和gRNA表达盒重构,Cas9和gRNA质粒共转化方法不仅克服了Cas9毒性还促使gRNA有效终止。本技术的基因敲除和基因插入效率分别达到60.0%和62.5%,另外开发的CRISPR/Cas9介导的ssDNA 重组能够精准的引入和点突变,效率超过80%。此方法也可对谷氨酸棒状杆菌进行双位点有效编辑。


文章脉络


1、优化Cas9 和gRNA的表达:用严格调控的Ptac启动子诱导调控Cas蛋白表达,组成型启动子P11F调控gRNA,TrrnB终止转录。


2、基因敲除与插入:以SL4(ATCC13869 衍生菌株,电转效率高)为出发菌,先电转pCas9质粒,再电转携带模板的pgRNA质粒,ldhA基因缺失阳性率8%,分析原因发现假阳性菌cas9基因或被删除,或无义突变失活,或者转座酶插入失活。本文作者开发的两质粒共转化方法,可减少pCas9的复制,Cas9突变减少,细胞阳性突变率达到47.3± 11.9%,基因插入效率25.0±8.3%。


3、CRISPR / Cas9和RecT介导ssDNA定向重组:按图1流程,六个碱基插入编辑效率86.7±5.8%,三碱基突变编辑效率70%。

  

CRISPR/Cas9和RecT介导的ssDNA定向重组SL4ΔldhA:: rfp
图1:CRISPR/Cas9和RecT介导的ssDNA定向重组SL4ΔldhA:: rfp


4、质粒消除:连续两次无抗消除质粒,消除效率约25.0%。


5、普适性:降低IPTG诱导浓度后,此编辑工具同样适用于野生菌株ATCC13969和ATCC 13032,基因缺失/插入编辑效率如下表1。另外,此编辑工具点突变效率90.0%,双位点点突变效率40.0%。

  

在谷氨酸棒状杆菌中CRISPR/Cas9介导的基因缺失和插入
表1:在谷氨酸棒状杆菌中CRISPR/Cas9介导的基因缺失和插入


DOI:10.1186/s12934-017-0815-5


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